基于金属团簇探针的细胞膜蛋白原位荧光标记与精准酶联免疫吸附定量分析

This proposal is to explore a highly sensitive and selective method for analyzing cell membrane proteins in situ. We will construct metallic cluster probes to specifically label the aimed proteins, and utilize their enzyme-like catalytic activity to quantify membrane proteins by mimic enzyme-linked immunosorbent assay. For early invasion and metastasis of pancreatic cancer cells, E-cadherin express level is regulated down while N-cadherin expression level is regulated up. In view of this typical characteristic, peptides with specific recognition and biomineralization talents will be designed to synthesize peptide-protected metallic clusters in a controlled manner. Thanks to molecular recognition ability of the peptides and various intrinsic physicochemical properties of metallic clusters (such as selective enzyme-like catalysis, inherent specific fluorescence and sensitive mass response), two cadherins mentioned above will be specifically labeled and quantitatively analyzed in situ by an accurate and sensitive way. Furthermore, we plan to exhaustively disclose the distinctions of their distribution and expression levels in pancreatic cancer cells at different pathological stages, and then systematically illustrate the relationship between the cadherin abnormal expression and invasion or metastasis potential of tumor cells. The novel cell analytical method as-established is expected to facilitate the assessment of clinical stage of pancreatic cancer patients and screen optimal treatments.

本项目拟探索高灵敏度、高选择性细胞膜蛋白原位分析方法。通过设计能特异标记细胞膜蛋白的金属团簇探针，利用金属团簇的类生物酶催化活性，发展针对膜蛋白的细胞原位酶联免疫吸附分析方法，在细胞水平上实现多种膜蛋白标志物的原位检测。胰腺癌早期侵袭与转移的典型特征是细胞膜表面E-上皮型钙粘连蛋白的表达下调与N-神经型钙粘连蛋白的表达上调。针对这一特征，我们将设计兼具特异性识别与生物矿化功能的多肽分子，可控制备多肽保护的金属团簇，结合多肽的识别能力与金属团簇的本征物化性质（包括选择性类酶催化、固有的特征荧光、灵敏的质谱响应等），直接在细胞上特异性标记与选择性检测上述两种钙粘连蛋白，建立准确、灵敏的原位定量分析新方法。进一步通过详细测定上述目标蛋白在不同病理期胰腺癌细胞中的表达量及分布，系统阐明它们与肿瘤恶化程度的量效关系，为指导临床癌症分期和筛选合理治疗方案提供新的细胞分析方法。

上皮间充质转化（Epithelial-Mesenchymal Transition，EMT），是上皮来源的恶性肿瘤细胞获得侵袭和转移能力的重要生物学过程。实时监测EMT对于预判肿瘤侵袭、转移以及预后具有重要意义。钙黏连蛋白家族是维持上皮细胞极性及细胞间连接的糖蛋白。其中，上皮型钙粘连蛋白（E-cadherin）的表达下降以及神经型钙粘连蛋白（N-cadherin）的表达上升触发肿瘤细胞EMT过程。本项目以E-cadherin与N-cadherin为生物标志物，通过理性设计和合成了系列靶向多肽分子，采用绿色生物矿化法，精准构筑了特异性识别E-cadherin和N-cadherin的多肽-金属团簇多功能生物探针。借助团簇探针的固有荧光性质，监测了蛋白标志物在肿瘤细胞膜上的分布状况。通过团簇探针的类酶催化或电催化性质，放大了荧光信号或电流响应信号，建立了基于团簇探针的细胞膜蛋白荧光分析或电化学分析平台，提升了蛋白标志物的分析灵敏度和准确性，实现了细胞水平上蛋白标志物的原位定量检测。进一步通过构建肿瘤细胞模型，阐明了蛋白标志物分布情况及其表达量与肿瘤细胞恶性程度（包括侵袭和转移）的对应关系，有望为指导临床癌症分期和筛选合理治疗方案提供新的定量分析方法。.基于以上研究，构筑了具有靶向肿瘤微环境的多肽-蛋白-金属团簇，在体外与活体水平上，系统研究了金属团簇选择性催化底物转化的规律和机理，并评价了金属团簇与生物大分子靶点的选择性识别能力。研究表明金属团簇通过在肿瘤微环境中持久选择性催化类芬顿反应和引发化学发光反应，提升肿瘤微环境氧化压力，实现了肿瘤的选择性催化治疗及其过程的灵敏实时光学监测。