人肾小球足细胞IgG4的表达及其在膜性肾病发病机制中的作用

Membranous nephropathy (MN) is the most common type of adult nephrotic syndrome. In situ immune complex formation induced by podocyte membrane protein is the main pathogenesis. By classical theory immunoglobulin (IgG) can only be produced by B cells, but recent study showed that non-B cells can also express IgG. So far there are no research reports if podocytes can express IgG which involved in the formation of in situ immune complexes in MN. In our pilot study, we found there were IgG gene rearrangement, IgG mRNA transcription and IgG protein expression in cultured human podocyte cell line. IgG expression can be up-regulated by inflammation. And interestingly the subclass is IgG4, which is similar to the IgG4-based immune complex deposition in MN patients. We propose the following hypothesis: podocytes can express IgG, especially IgG4; inflammation can up-regulate IgG expression by podocyte and play a role in the pathogenesis of MN. The purpose of the study is to further clarify physiology and pathology of podocyte sourced IgG and its role in the pathogenesis of MN. And try to prepare the podocyte-derived IgG variable region dominant rearrangement gene probe and the corresponding dominant peptide chain antibodies, in order to explore new diagnostic method and treatments of MN.

膜性肾病（MN）是成人肾病综合征最常见的类型，足细胞膜蛋白作为靶抗原，诱导原位免疫复合物形成，是主要发病机制。经典理论认为免疫球蛋白（IgG）只能由B细胞产生，新的研究发现非B细胞也能表达IgG，参与细胞生命活动。足细胞能否表达和分泌IgG，参与MN原位免疫复合物的形成，目前国内外没有相关研究报道。本课题组在体外培养的人肾小球足细胞系开展探索性研究，初步证实足细胞存在 IgG基因重排、mRNA转录和IgG蛋白表达，炎症可以上调其IgG的表达，以Ig γ4链为著，与MN患者肾脏沉积的免疫复合物以IgG4为主相似。我们提出如下假说：足细胞可以表达IgG，且以IgG4为主；炎症能上调其表达并在MN发挥一定作用。拟通过本课题，进一步明确生理和病理状态下足细胞来源IgG的表达，及其在MN发病机制中的作用；并通过制备足细胞来源IgG可变区优势重排基因探针及相应优势肽链抗体，探索新的诊断治疗手段。

本项目依据非B细胞可以产生免疫球蛋白（Ig）的基础研究报道和膜性肾病（MN）的病理生理特点对肾小球足细胞能否通过产生IgG参与MN发病进行研究。.首先，我们开展人足细胞（HPC）IgG基因转录和重排的研究。结果显示：①体外培养的足细胞系HPC存在Igγ、Igγ4、Igk、Igλ的基因转录和V(D)J重排；IgG重链和轻链重排模式保守，SAC可以改变足细胞IgG的重排模式；②10×Genomics技术检测到足细胞IgG基因转录及 V、D、J 基因片段，但是没有拼接成有功能的VDJ重排序列；巢式PCR联合Sanger测序技术在人的48个足细胞中检测到Ig基因转录和重排，足细胞重排模式相对保守，使用VH1频率高于B细胞；意外发现，足细胞可以同时表达多种Ig，肾病患者足细胞Ig体细胞高频突变频率升高。.其次，我们开展HPC表达IgG蛋白的研究。结果显示：①HPC可以表达IgG，以IgG4为主；siRNA敲减IgG后，足细胞活力和粘附力下降，细胞骨架发生变化；致病因子SAC、LPS、高糖、氧化型低密度脂蛋白和同型半胱氨酸诱导HPC高表达IgG和IgG4，并且IgG4与PLA2R共定位。结果提示，生理状态下，足细胞可以产生少量的IgG和IgG4，维持细胞的生存、黏附和骨架形成；在致病因子刺激时，足细胞产生大量IgG4，作为PLA2R的抗体参与MN发病。.再次，我们在野生型小鼠和B细胞缺陷的μMT小鼠检测足细胞IgG蛋白表达，结果显示μMT小鼠足细胞可以表达IgG，表达量超过野生型小鼠。.最后，我们构建了IgH条件性敲除的小鼠，并与NPHS2-Cre小鼠进行交配，得到了足细胞特异性条件性敲除Ig的小鼠NPHS2-Cre＋IgHfl/fl，为后续研究足细胞来源的IgG在MN发生发展中的作用奠定了基础。.总之，本项目首次提出并阐明足细胞异常表达和分泌IgG可能参与MN的发病，创新或者完善了MN的发病