肠炎沙门氏菌非编码小RNA STnc640在调控粘附力上的相关功能研究

sRNA是一种调控因子，可通过感应环境变化快速调节基因的表达。由菌毛参与的粘附过程是肠炎沙门氏菌侵袭宿主至关重要的第一步。STnc640是该菌中功能未知的一种sRNA，我们利用TargetRNA靶标预测技术发现菌毛亚单位基因bcfA和fimA可能受STnc640的调节，推测STnc640通过调节菌毛基因的表达，调控对宿主细胞的粘附作用。在此研究基础上，本项目将构建STnc640缺失突变株和回复突变株，通过细胞粘附试验和动物感染试验分析突变对肠炎沙门氏菌粘附力的影响。通过突变造成的bcfA和fimA 表达量的变化分析STnc640对bcfA和fimA表达的调节作用，并利用LacZ报告基因融合技术和凝胶阻滞实验深入研究STnc640对bcfA和fimA调控的分子机制。本项目的开展将揭示STnc640在调控肠炎沙门氏菌粘附宿主细胞中的功能，为研究sRNA在沙门氏菌毒力调控中的功能提供理论基础。

细菌非编码小RNA（sRNA）可在转录后水平调节基因的表达，是近年来新发现的一类基因调节子。STnc640是一种功能未知的依赖于伴侣蛋白Hfq的sRNA，通过TargetRNA软件预测bcfA和fimA可能是STnc640的靶标基因，推测其对菌毛介导的细菌毒力具有调控作用。为研究STnc640在调控粘附力和致病性上的功能，本项目克隆了肠炎沙门氏菌stnc640基因，利用qRT-PCR检测到STnc640转录水平在细菌生长的稳定后期达到最高。通过λ-Red同源重组系统构建了肠炎沙门氏菌50336 stnc640基因缺失株50336△stnc640，并构建了回补株50336△stnc640/pstnc640。生长曲线测定结果显示，50336△stnc640和野生株的生长速率无明显差别。利用qRT-PCR检测比较了野生株、STnc640突变株和回补株中主要菌毛亚单位bcfA、fimA、sefA、safA、stbA、sthA、csgA、csgD、pegA，外膜蛋白ompD和鞭毛蛋白fliC的表达。结果显示，相比50336，50336△stnc640中fimA、sefA、csgD和外膜蛋白ompD均表现下调。细胞黏附试验结果显示，相比野生株，50336△stnc640对Caco-2的黏附能力上升。动物感染试验结果表明50336△stnc640对雏鸡的毒力增强。推测stnc640通过影响菌毛fimA、sefA、csgD、外膜蛋白ompD以及调控其他未知靶标基因的表达影响细菌的毒力。STnc640对Hfq的依赖性检测结果显示，50336△hfq中STnc640水平只有野生株的2%，表明STnc640的稳定性依赖于Hfq。另外，利用pET28蛋白表达系统和镍亲和层析法表达纯化了Hfq蛋白，将地高辛标记的STnc640与纯化的Hfq蛋白进行凝胶阻滞实验，探索了STnc640是否与Hfq共同作用发挥调控功能。本项目的开展揭示了STnc640在沙门氏菌粘附和毒力调控上的功能，为研究肠炎沙门氏菌致病机理提供了理论基础。