鼠疫耶尔森氏菌调节小RNA的筛选、鉴定和初步功能验证

调节小RNA指那些不编码蛋白质即可调节基因表达或蛋白质活性的一类RNA，其广泛存在于生物体中，参与多种细胞生理过程。对于病原细菌基因组小RNA的鉴定将有助于圈定致病相关小RNA，进而揭示其在致病过程中的作用。鼠疫耶尔森氏菌是一种烈性病原体，目前研究结果提示调节小RNA与鼠疫菌毒力密切相关。然而，目前对于鼠疫菌小RNA的鉴定仍处于计算机预测阶段，缺乏实验证据。本课题体外模拟鼠疫菌感染过程中可能遇到的多种胁迫环境，分离获得小片段RNA，利用RNA组学和RNA测序两种方法，旨在全基因组范围内鉴定可能的调节小RNA，完善鼠疫菌基因组小RNA注释,并利用传统实验方法验证部分调节小RNA转录本特征。在此基础上，挑选部分感兴趣的调节小RNA进行初步的功能验证，圈定重要功能特别是致病相关的调节小RNA。

调节小RNA的鉴定和初步的功能筛选有助于深入开展病原细菌的生理和致病机制方面的研究。鼠疫耶尔森氏菌是烈性传染病鼠疫的病原体，目前已经证明：RNA结合蛋白Hfq在鼠疫菌体外应激和致病过程中发挥重要作用，提示与Hfq密切相关的小RNA可能参与鼠疫菌生理和致病。本项目选择提取5种重要模拟条件和感染动物脏器内的鼠疫菌总RNA，以尽可能全面地覆盖鼠疫菌基因组内的小RNA，并利用cDNA文库与高通量测序技术相结合，综合二者优势，全面鉴定了鼠疫菌小RNA，并使用高通量测序方法测定感染动物内细菌总RNA，成功鉴定出138个小RNA，丰富了鼠疫菌的基因组特别是间区和反义链上的基因注释。此外，利用Northern和RT-PCR等传统方法，验证了30个小RNA在不同体外条件下具有不同的转录特征。挑选体外高表达、体内外差异表达或可能调控重要靶标基因的小RNA，以鼠疫菌野生株201为背景，分别敲除其编码基因，共获得20个鼠疫菌小RNA缺失突变株，进行生长特性、体外应激和致病性的初步评价，最终获得了相关8个小RNA，与生理代谢、生物膜形成和/或致病相关，正在作为靶标进行深入的功能调控研究。