化合物组合LCDM对着床前胚胎命运决定的影响及其作用机制

Mammalian preimplantation embryo development involves a series of important events. During the procedure from zygote to the compacted embryos, cells have the developmental potential into the whole body, including the offsprings, that are considered to be totipotent. Thereafter, two fate decisions occur, with totipotency decline. Till the late blastocyst stage, the embryonic cells lose totipotency totally. We have found in the previous study that LCDM, which is composed with the leukocyte inhibitor LIF, GSK3β inhibitor CHIR 99021, G protein coupled receptor inhibitor (S) - (+) - Dimethindene maleate (DiM) and Parp1 inhibitor Minocycline (MiH), can delay the development of embryos during the morula stage. Considering the traditional pluripotent stem cells cultured in the medium containing this cocktail will be endowed with the biopotent developmental potential, both into embryonic and extraembryonic tissues, which can be regarded as totipotent-like, it suggests that this cocktail can regulate totipotency and embryo development. However, the detailed molecular mechanism remains elusive. In this study, we plan to investigate the effects of LCDM cocktail on two processes of embryo development, one is from the zygote to the blastocyst stage while the other is from the 8-cell to the blastocyst stage. In combination with single cell RNA sequencing technology, the differential genes were screened and the function of 3-4 differential genes was validated to explore the regulatory mechanism of this combination on the process of embryonic development. This will also help us to understand the regulation mechanism of totipotency.

哺乳动物植入前胚胎的发育包含一系列重要事件，在发生致密化前，细胞可以发育成所有器官并具有产生后代的能力，被认为具有全能性。其后将发生两次命运决定，细胞的全能性也随之降低，至中晚期囊胚阶段，完全失去全能性。本申请人在前期研究中发现，由白细胞抑制因子LIF，GSK3β的抑制剂，G蛋白偶联受体的抑制剂以及Parp1的抑制剂组成的组合LCDM可以使小鼠体外培养的胚胎发育至桑葚胚期后出现发育延缓的现象。而该组合可以赋予传统的多潜能性干细胞胚胎、胚外组织的双向发育潜能，即类全能性，但是具体分子调控机制不明。因此，本项研究拟通过在传统小鼠早期胚胎培养液KSOM中添加LCDM的四个组分，研究其对受精卵向囊胚发育和8细胞胚胎向囊胚发育两个过程的影响。并结合单细胞RNA测序技术，筛选差异基因，并进行功能验证，探究该组合对胚胎发育过程的调控机制，为了解其对胚胎全能性及细胞发育潜能的调控提供新线索。

从不同发育阶段的胚胎获得的多潜能干细胞（PSCs）具有与相应阶段的胚胎细胞相似的分化潜能与分子特征，我们由此推测赋予PSCs相应分化潜能与分子特征的培养体系可能对早期胚胎的发育产生相似的影响，对其进行研究有助于我们深入理解早期胚胎细胞命运决定的机制。早期研究结果表明超潜能干细胞（EPS）具有发育为胚胎、胚外组织的双向发育潜能，故而本课题围绕EPS的培养条件中的化学小分子/细胞因子组合LCDM如何调控小鼠植入前胚胎发育这一问题，通过在培养受精卵发育至囊胚的过程中添加LCDM组合及其组分，探讨其对小鼠胚胎发育、特别是第一次命运决定的影响。.本项目首先发现LCDM组合抑制小鼠植入前胚胎的发育、促进滋养层细胞的特化，继而通过单减、双减的策略以LCD、LCM、LC分别处理胚胎，发现LCDM对小鼠囊胚形成的抑制作用可能是由LC主导的，但其不会促进滋养层细胞的特化，结合DiM与MiH在干细胞多能性维持、胚胎发育方面的研究也很少，本课题将研究重点转移至DiM与MiH，发现DiM对于着床前胚胎的发育进程、第一次命运决定、囊胚形成均无明显影响，因此最终聚焦MiH。.本课题最终发现MiH虽然在2-细胞至早期囊胚阶段会延缓胚胎的发育进程，但是并不会影响最终的囊胚形成效率、总细胞数，同时也会促进第一次细胞命运决定时卵裂球细胞向滋养层细胞特化。继而，本课题采用FDA批准的两个经典PARP1抑制剂药物处理小鼠胚胎，能够取得相似的效果，说明该作用确实是通过抑制PARP1进行调控的。除了计划内的研究内容，本课题还设计了体外长时间暴露实验，发现MiH对不良环境暴露的胚胎具有一定的修复作用，这种修复可能是通过抑制细胞内的ROS积累起作用的。进一步，本课题以过氧化氢诱导的小鼠受精卵损伤模型，验证了PARP1抑制剂可以通过抑制过氧化氢引起的Parp1过度激活来降低细胞内ROS水平，从而修复胚胎的发育能力。这一发现对于临床工作中由于不可避免的观察胚胎而对胚胎产生的不良影响或许能起到一些保护作用，具有一定的应用价值。.此外，本课题在执行过程中，还改良了小鼠卵圆柱胚胎的体外培养体系，利用该体系，我们可以更加便捷的在体外实现对囊胚进一步发育能力的评价，并实时观察小鼠卵圆柱期胚胎各细胞谱系的特化。