基于蛋白组学的油菜高油酸关键基因鉴定研究

Rapeseed oil with high oleic acid have satisfied nutrition and health functions, so it attracted more and more attention in the world. But most of the studies of high oliec acid rapeseed fatty acid synthesis based on genes, and there has no such study based on protein has been reported. The near-isogenic lines seed of rapeseed which fatty acid formation period seeds of rapeseed were used as raw materials in this study, just as follows: (1) the protein was extracted by TCA/acetone extraction method, and then pretreated by ProteoMiner protein enrichment kit, the differentially expressed proteins were found out by two-dimensional gel, (2) differentially expressed proteins were idified by mass spectrometry analysis or sequencing analysis, and the names and species of the proteins were predicted by correlative softwares, then was screened by Western-blot method or RT-PCR method to find out the strategic proteins and the corresponding genes. (3) 2-3 genes corresponding to the strategic proteins were cloned and then transferred to Arabidopsis for functional verification. The proteins relevant to the fatty acid synthesis of high oleic acid rapeseed can be found out in this study, which will the helpful to the study of molecular mechanism of fatty acid synthesis, and accelerate the development of high oleic acid rapeseed.

高油酸菜油有很好的营养保健功能，因而高油酸油菜育种研究是目前油菜育种研究的一个重点，但其脂肪酸合成分子机理尚未完全搞清，且相关的研究也多集中于基因方面，尚无蛋白方面研究的报道。本研究以油菜近等基因系材料脂肪酸形成期种子为研究对象进行研究，主要研究内容包括：（1）采用TCA-丙酮沉淀法提取蛋白质，ProteoMiner低丰度蛋白富集系统预处理蛋白，利用双向电泳的方法展现差异蛋白点；（2）对差异显著的蛋白点进行质谱或测序分析，并利用相关软件进行分析，进而采用Western-blot或RT-PCR方法验证，筛选出对脂肪酸合成起影响作用的关键功能蛋白及其对应基因；（3）克隆2-3个关键功能蛋白对应基因，并在拟南芥中做基因功能验证。预期通过本研究筛选出影响高油酸油菜脂肪酸合成的关键功能蛋白及其对应基因，促进高油酸油菜脂肪酸合成分子机理的研究，加快高油酸油菜的育种进程。

高油酸菜油有很好的营养保健功能，因而高油酸油菜育种研究是目前油菜育种研究的一个重点，但其脂肪酸合成分子机理尚未完全搞清。本研究以油菜近等基因系材料脂肪酸形成期种子为研究对象进行研究，取得了如下结果：.（1）湘油15与高油酸材料15天幼苗为材料，采用双向电泳与质谱结合的方法进行研究，对其中50个差异蛋白进行鉴定，48个获得成功，分类分析表明，大部分蛋白为碳水化合物及能量代谢相关蛋白（39个），4个位防御保卫相关蛋白，5个为其它蛋白，发现2个蛋白与脂肪酸代谢相关。.（2）以油酸含量分别为81.4%和56.2%的高油酸油菜近等基因系脂肪酸形成期种子为材料，进行iTRAQ分析，得到谱图340528张，通过Mascot软件进行分析后，匹配到的谱图数量是67334张，其中Unique谱图数量为33968张，共鉴定到4726个蛋白，24755个肽段，其中含14455个Unique 肽段。依据iTRAQ分析结果进行后续研究，以β-actin为内参，完成油菜3个蛋白（PSaB，Lhcb6和ALD）的western-blot验证，结果与iTRAQ结果一致，表明iTRAQ分析结果可靠。在与脂肪酸合成相关的差异蛋白对应基因中，有5个为脂肪酸合成的关键基因，其中acyl-CoA thioesterase, 3-ketoacyl-CoA reductase, omega 6 reductase和Acyl-CoA dehydrogenases 参与脂肪酸代谢，其中FAD6和acyl-CoA thioesterase与油酸合成相关。.（3）以高油酸油菜近等基因系材料脂肪酸形成关键期种子为材料进行了转录组分析（低油酸油菜为对照组），共得到8.09-Gb clean reads，组装得到 52361 unigenes, 平均长度659 bp。其中 48911 (93.41%) unigenes 显著接近公共蛋白质数据库的序列，鉴定得到6414 个差异基因，其中在高油酸油菜中1296 (20.21%) 个上调表达，5118 个(79.79%) 下调表达。富集表达的2043个差异基因分为119个代谢通路，5个与脂肪酸代谢相关，9个与光合作用相关，还研究了这些基因在油菜不同生育期的表达规律。.本研究有助于促进高油酸油菜脂肪酸合成分子机理的研究，加快高油酸油菜的育种进程。