红三叶草坏死花叶病毒RCNMV“智能”介导小鼠乳腺肿瘤原癌基因HER2/neu沉默研究

近年来我国乳腺肿瘤发病率呈上升趋势，如何有效防治成为研究热点。本项目在Steven Lommel等工作基础上，选用在稳定性、生产容易程度、靶向特定细胞、携带药物等方面具明显优势的红三叶草坏死花叶病毒RCNMV，进行Luciferase标记，添加HER2/neu单链抗体片段、转铁蛋白等提高靶向性；体外包装沉默乳腺肿瘤原癌基因HER2/neu 特异性siRNA 。转染SKBR3(HER2+)、MCF-7(HER2-)细胞进行体外实验、转染乳腺肿瘤小鼠模型进行体内试验。利用激光共聚焦、活体生物发光成像、NorthernBlot、WesternBlot、RealtimePCR等技术研究标记RCNMV在细胞和小鼠模型体内迁移与定殖规律及乳腺肿瘤侵染与转移情况，揭示RCNMV"智能"介导乳腺肿瘤原癌基因HER2/neu沉默效率。本项目有望为乳腺肿瘤靶向治疗提供新方案，为肿瘤基因及个体化治疗探索新思路。

利用植物病毒建立靶向药物传输系统为肿瘤的基因治疗及个体化治疗提供了一条新思路。本项目设定在Steven Lommel等工作的基础上，人工表达红三叶草坏死花叶病毒RCNMV外壳蛋白CP的单体，并对其进行靶向性修饰，体外组装病毒粒子，包装沉默乳腺肿瘤原癌基因 HER2/neu 的特异性siRNA，构建人工智能靶向药物传输系统。本项目组针对NCBI公布的RCNMV外壳蛋白CP的RNA序列信息（BAA86875.1），经密码子优化，人工合成CP序列，分别利用pET系列、pGEX系列、pMAL系列等载体，筛选不同宿主菌株，优化表达条件。其中pET28a重组载体经IPTG诱导得到少量包涵体，但包涵体复性后的CP蛋白没有生物学活性；pMAL系列载体则出现含空载体宿主菌经IPTG诱导后MAL表达量较高，而含重组载体的宿主菌经IPTG诱导后菌体量显著降低。利用pPIC9K，pGADT7等酵母真核表达载体未能表达出CP蛋白。含有融合增强型绿色荧光蛋白（EGFP）的靶向性修饰的CP蛋白单体也未能表达成功，从而使本项目的后续研究无法开展。本项目后期将针对CP序列重新优化密码子，更换合成公司，目前相关试验正在进行，期待能够实现预期目标!