星形胶质细胞Connexin43在大脑皮层梗死继发丘脑变性中的作用及机制研究

The mechanism of secondary damage after cortical infarction is not fully understood, many factors may be involved, such as axonal degeneration, neurotrophic disorders, inhibition of protein synthesis, oxidative damage and so on. The gap junction protein connexin43 (Cx43) is widely expressed in adult astrocytes and forms intercellular channels for the transfer of small molecules between the cytoplasm of adjacent cells. Many researches have showed that cathepsinB (CathB) degradation of Cx43 protein after focal cerebral ischemia, then preventing the formation of Cx43 channels. But the relationship between the CathB and Cx43 in the secondary damage after cortical infarction is not fully understood. In order to confirm the hypothesis that the CathB degradation of Cx43 protein and hinder the formation of Cx43 channels, causing extracellular ATP levels decreased, resulting in nerve cell damage in the secondary damage after cortical infarction. We intend to investigate the role of CathB-Cx43 in the secondary damage of thalamus after cortical infarction in rats and analyze the effect of Cx43 on extracellular ATP levels in vivo and in vitro. The research results will elucidate the mechanism of Cx43 on secondary damage in thalamus after cortical infarction through a new visual angle.

目前对脑皮层梗死后继发丘脑变性的机制尚未完全阐明，多认为与轴突退行性改变、神经营养障碍、氧化损伤等因素有关。但原发灶损伤的神经细胞是如何介导下级神经细胞受损仍不清楚。而Connexin43(Cx43)作为连接相邻细胞的通道蛋白，在星形胶质细胞中大量表达，对小分子物质(如无机离子、ATP、葡萄糖等)在细胞间传递中发挥重要作用。有研究显示，星形胶质细胞中组织蛋白酶B(CathepsinB，CathB)在脑卒中后被激活，降解Cx43，阻碍ATP在细胞间的输送。但Cx43在脑皮层梗死后继发丘脑变性中的作用仍知之甚少。本课题拟制备大鼠大脑皮层梗死模型，探讨星形胶质细胞中CathB-Cx43途径在丘脑中对ATP输送的影响以及在神经元变性的作用；然后在体外细胞实验中进一步验证CathB-Cx43-ATP之间的调控机制。本研究有望进一步阐明脑梗死继发性损害的特点和机制，为有效防治继发性损害提供新的思路。

目前对大脑皮层梗死后继发丘脑变性的机制尚未完全阐明，多认为与轴突退行性改变、神经营养障碍、蛋白合成抑制、氧化损伤等因素有关。但原发灶损伤的神经细胞是如何介导下级神经细胞受损仍不清楚。而Connexin43(Cx43)作为连接相邻细胞的通道蛋白，在星形胶质细胞中大量表达，对于维持神经细胞的新陈代谢、内环境稳定、传递小分子物质（如无机离子、ATP、葡萄糖等）发挥着重要作用。我们的预实验和其它研究结果显示，星形胶质细胞中组织蛋白酶B(CathepsinB，CathB)在脑卒中后被激活，并从溶酶体释放进入胞浆降解Cx43，阻碍ATP在细胞间的输送。但Cx43在大脑皮层梗死后继发丘脑变性中的作用仍知之甚少。本课题拟制备大鼠大脑皮层梗死模型，探讨星形胶质细胞中CathB-Cx43二者在丘脑中的相互作用关系，表达变化与胞外ATP水平之间的关系以及在神经元变性中的作用；然后在星形胶质细胞-神经元共培养体系中进一步验证CathB-Cx43-ATP之间的调控机制。. 大鼠大脑皮层梗死后可导致丘脑黑质组织CathB，Cx43表达增加，CathB并从溶酶体中释放至胞浆，甚至到胞外，免疫荧光表现为从颗粒状变为均质状。与Sham组相比，Vehicle组中丘脑神经细胞明显丢失，神经元发生变性；同时，丘脑黑质部位有大量的星形胶质细胞被激活，胞体肥大、突起增长，且交织成网状，说明大脑皮层梗死后可导致丘脑黑质损害。研究结果还显示在Sham组，丘脑黑质组织中CathB只与神经元共表达，而在大脑皮层梗死3W后，胶质细胞中CathB被激活，免疫荧光显示CathB与星形胶质细胞标志物胶质纤维酸性蛋白GFAP和小胶质细胞标志物Iba共表达。侧脑室注射CathB抑制剂CA-074Me，可阻止CathB从溶酶体中释放进入细胞质，明显降低胶质细胞的激活和CathB、cleaved caspase-3的表达; 给予Cx43抑制剂也同样减轻同侧丘脑部位变性神经元和神经元细胞丢失减少。. 本研究有望进一步阐明脑梗死继发性损害的特点和机制，有助于丰富继发性损害的防治方法和手段，为寻找脑卒中继发性损害的防治思路和治疗靶点提供新的实验参考。同时，针对脑卒中继发性损害的治疗也有可能进一步扩展脑梗死治疗的时间窗，改善脑卒中神经功能恢复，具有重要的科学意义及潜在的临床应用价值。