干旱胁迫下金钗石斛叶肉细胞液泡膜水通道蛋白的表达与pH调控

Aquaporins facilitate water movement through cell membranes in all living organisms, which is crucial for horticultural crops to combat drought stress. Onset of drought, the facultative CAM mechanism of some orchids usually triggers the transition from C3 to CAM pathway in their photosynthetic carbon assimilation. However, the molecular mechanism on how aquaporins are regulated during adaptation to drought is still elusive. Here, we use Dendrobium nobile, one of the typical facultative CAM plants, to determine the dynamics of tonoplast intrinsic proteins in leaves. Firstly, isolation and characterization of genes encoding tonoplast intrinsic proteins will be conducted. Then we will detect differential expression of the genes and analyze abundance changes of aquaporins located in vacuole membrane. Finally we will unravel the regulation mechanism of the aquaporins by pH during the transition from C3 to CAM process under drought stress. In the course of the investigation, some new methods and techniques including fluorescence correlation spectroscopy and microfluidics will be used to probe the roles of tonoplast intrinsic proteins in the early response events of plants under water stress. The proposed experiments will dissect mechanisms on how drought tolerance is improved in CAM plant and motivate technological innovations of oriented cultivation of Dendrobium orchids.

水通道蛋白是一类广泛存在于生物体内的水分子跨膜转运通道蛋白，在园艺作物干旱胁迫响应过程中发挥重要作用。部分兰科植物在干旱胁迫时，其兼性景天酸代谢（CAM）机制会启动从C3到CAM途径的转换，增强了自身耐旱能力。然而，水通道蛋白在此过程中的作用尚不清楚。本研究将从上述特性出发，拟以兼性CAM植物金钗石斛为实验材料，重点研究干旱胁迫条件下，金钗石斛的叶肉细胞在光合作用碳同化途径转换为CAM前后，其液泡膜水通道蛋白的变化动态。具体包括：(1)液泡膜水通道蛋白基因的克隆与分离鉴定，(2)液泡膜水通道蛋白基因的差异表达和膜上丰度的变化，(3)液泡膜水通道蛋白受pH的调控机制。本研究将利用荧光相关光谱和微流控芯片等新技术，揭示水通道蛋白在兼性CAM植物适应干旱过程中的分子调控机制，从而促进石斛兰的定向培育技术创新。

金钗石斛在我国石斛属植物中分布范围最广，作为传统药用植物和观赏植物，它是重要的育种亲本。然而，即便是在贵州赤水金钗石斛地理标志产品保护地，最为适合金钗石斛生长的地区，也会在生长季节出现干旱胁迫，导致光合作用碳同化途径转向景天酸代谢途径，以同化作用的损失来代偿干旱胁迫耐受性。经过干旱胁迫，与景天酸代谢途径相关的磷酸烯醇式丙酮酸羧化酶同工酶的活性就会增加，夜间二氧化碳吸收也会增加。干旱初期，低水平苹果酸含量和胞间二氧化碳分压还不至于导致气孔完全关闭，二氧化碳固定可以全天24小时发生，然而净光合作用速率一直处于很低水平。随着干旱胁迫的逐渐延长，碳同化途径转变为景天酸代谢形式。正常栽培条件下金钗石斛的快速荧光动力学曲线趋势曲线上升更快，而干旱胁迫后的荧光动力学曲线很快趋于平缓，J峰和I峰不突出。金钗石斛常态下J、I点分别出现在1.77ms、8.42ms, 荧光强度较高，相对数值在J点为1.59、I点为1.85、P点为2.36,而干旱胁迫后分别是0.862、0.903、1.112。干旱胁迫金钗石斛开放的PSⅡ反应中心和相对处于氧化状态的P700, 使得电子传递途径相对畅通，维持低水平的光化学反应。正常金钗石斛P值变化幅度大，最大值为0.471，而短期干旱胁迫金钗石斛为0.212。干旱胁迫初期，金钗石斛叶肉细胞液泡膜水通道蛋白表达量有增加趋势。.经过20天干旱胁迫的金钗石斛，荧光产量高，OJIP各阶段区分明显。暗适应后，作为CAM植物，长期干旱胁迫的金钗石斛在黑暗期间气孔开放，积累二氧化碳于苹果酸中，储存于液泡内；苹果酸脱羧释放二氧化碳，供给卡尔文循环的底物。一旦施加作用光，则进入大体相当于CAM植物日变化节律的第Ⅱ阶段，PEPC、Rubisco羧化酶共同起作用，二氧化碳同化速率达到最高状态。随着干旱胁迫时间的延长，金钗石斛叶肉细胞液泡膜水通道蛋白表达量有所下降。.金钗石斛通过调整水通道蛋白实现对水分的高效转运，适应短期干旱;若干旱时间过长，则光合作用机构可能受到伤害，水通道蛋白表达受到影响，最终不利于生物量的积累。