燕麦源ACE C-结构域选择性抑制肽的高效筛选及体外活性机理研究

包含两个结构域（C-、N-结构域）活性的ACE是心血管疾病治疗的重要靶标之一，其中C-结构域活性起着决定性作用。然而目前一线ACEI类药物或活性肽均属结构域混合型抑制剂，存在副作用大、特异性不强等问题，因此从分子水平上研究ACE的C-结构域活性机理并针对性设计新一代强特异性ACEI是目前亟待解决的问题。本项目正是以这一重要科学问题为切入点，提出以燕麦为原料，系统研究燕麦源ACE C-结构域选择性抑制肽的酶膜耦合联用亲和色谱的高效制备与筛选策略；在此基础上，运用分子对接技术和量子化学计算方法从理论上探讨目标肽与ACE的相互作用问题，并进一步采用晶体X射线衍射分析和肽结构定向改造技术对理论分析进行实验验证，最终阐明肽的体外活性机理。本项目的成功实施将为燕麦的开发利用提供合理途径，为ACE C-结构域选择性抑制肽的高效筛选提供新思路，并对阐明其活性机理和设计新一代ACEI具有重要理论指导意义。

本项目基本按照申请书的预定内容与路线逐步实施，达到预期目标，取得如下成果：（1）以燕麦蛋白为原料，以生产强活性ACE抑制肽为目标，利用不同商品蛋白酶分别对燕麦蛋白进行酶解，考察各自产物不同水解度与IC50的对应关系，成功筛选出最佳蛋白用酶为Alcalase；（2）在此基础上，搭建了酶膜反应器装置，详细考察了酶膜反应器装置中超滤膜的选择、底物浓度、操作温度、操作压力等因素对操作效率和产物ACE抑制活性的综合影响，得到一套优化的ACE抑制肽的酶膜反应器系统进行ACE抑制肽的初筛；（3）对ACE抑制肽粗产品利用tACEΔ36-g13亲和色谱柱进行精筛，成功获得两种ACE C-结构域选择性抑制肽，经活性分析与结构鉴定，确定两种肽分别为GY和IRP，Ki(N)/Ki(C)值分别为52.3和78，表明两种肽均对ACE C-结构域有较强的选择性抑制活性；（4）采用分子对接技术，结合理论计算结果，分析了两种目标肽与tACE的作用模式与机制；进一步对肽分子结构进行定点突变改造，比较分析了各突变体与tACE的结合关系，总结提炼了影响肽活性的关键氨基酸残基信息为：二肽中碳端羟基与氮端氨基为关键基团，三肽中碳端羧基与氮端氨基为关键基团。ACE中Glu384、Lys511、Tyr520为最重要的活性位点。. 到目前为止，本项目已发表（含已录用）研究论文21篇，其中6篇SCI收录，申请发明专利8项，授权2项，参加国内外学术会议5次，培养研究生3名，超额完成了既定任务。