蚂蟥药效物质基础及质量标准研究

蚂蟥Whitmanina pigra是中国药典水蛭品种之一，是传统的抗凝抗栓中药，临床应用广泛，但其活性成分一直未有报道，质量标准也很不规范。课题组前期对蚂蟥化学成分及其抗凝抗栓活性进行了研究，发现从中分离出的whitmanin（蚂蟥多肽）等多肽类化合物具有很好的抗凝抗栓活性，作用与水蛭素（hirudin）相当。为了透彻的了解蚂蟥中的活性多肽及其药理作用机制，我们以抗凝活性为指标，对多肽进行系统分离纯化及氨基酸序列和空间构型等分析；建立快速检测抗凝抗栓作用的体内、体外实验模型，阐明新多肽抗凝抗栓作用的分子机制；并以活性多肽的含量为指标，建立蚂蟥药材质量评价体系。本项目将阐明蚂蟥的抗凝活性物质基础及作用机制，为蚂蟥的临床应用及蚂蟥的质量标准建立提供更充分的科学依据，新活性多肽的发现将为心脑血管药物研发提供新目标化合物，并为随后研制蚂蟥多肽冻干粉针提供基础数据，具有潜在临床应用价值及经济效益。

大量的研究表明蚂蟥抗凝血作用非常好，是临床应用的主要水蛭品种。但目前为止，其活性成分报道很少，质量控制技术研究也不够深入。本课题即从这两个方面展开研究，主要研究内容及结果包括：.1、以血浆复钙时间（PRT）为指标，应用凝胶过滤色谱及HPLC等技术从蚂蟥提取物中分离得到3个抗凝血活性多肽，其中化合物1和2在自然条件下相互转化，分子质量分别为7100和5531；MALDI-TOF-MS法测定化合物3分子量为8608，并测定其氨基酸组成。.2、从13种溶剂系统中筛选出蚂蟥药材的最佳提取溶剂系统：丙酮—水(10%，v/v)，以PRT为指标，通过凝胶过滤色谱及HPLC得到两个活性多肽。第一个用MALDI-TOF-MS法测得其分子量为1574.7 Da，用高分辨质谱测得其部分序列为CNQSQY（I/L）R。第二个是分子量为29415 Da的多肽，其等电点为6.69，部分序列为K.LYNSLSHEDKR.Q。.3、用石油醚索氏提取蚂蟥药材中的总脂肪酸，并证明该脂肪酸提取物具有显著抗凝活性。GC-MS法分析鉴定出九个新脂肪酸成分。.4、建立了一种测定蚂蟥药材中蚂蟥多肽含量的新方法，Hypersil-C18柱；流动相乙腈-水（2：98），0.03%的KH2PO4，pH3.80：波长280 nm；流速1.0 mL/min，柱温35℃。当whitmanin的质量浓度在186-942 mg/L时，峰面积与质量浓度的线性关系良好（r = 0.9996）；平均回收率为99.8%，RSD<2%。该方法准确可靠，可作为蚂蟥药材的质控方法。.5、用凝血酶法和PRT法分别测定了五地购置的蚂蟥药材，结果显示凝血酶效价大小及PRT大小均为长沙>毫州>巴龙>永川>安国，PRT法可作为蚂蟥药材质量控制补充方法。采用Lowry法测定了这五地蚂蟥的蛋白质含量，依次为189.9、162.2、150.2、144.2和131.4、μg/mg，与抗凝活性大小一致。.6、分别采用肝素生物定法和PRT法测定蚂蟥提取物的抗凝效价，用量反应平行线法（3×3）进行评价。结果效价分别为195.550 和195.351 u/mg，可信限FL%分别为3.7%和2.2%，回归显著，偏离平行、二次曲线、反二次曲线均不显著（P>0.05）。区组间差异不显著，剂量差异显著，方法重复性良好。重复五次结果无显著性差异，PRT法可以代肝素生物测定法。