MicroRNA介导的IGF-1及其受体基因沉默与端粒酶和鹿茸干细胞增殖抑制关系的研究

鹿茸是一种神奇的名贵中药，不仅具有其独特的药用价值，而且具有重要的科学研究意义。鹿茸再生是生物学种的奥秘，它是研究再生基本过程的一个天然模型。如果能够了解这种机制，对人类健康、人类组织和器官工程有很大的意义。本课题着重放在以下几方面：建立鹿茸干细胞体外短期培养方法,分析鹿茸干细胞端粒系统的生物特性，检测不同培养时间鹿茸干细胞端粒酶活性的变化以及与细胞增殖速率的关系；侧重利用microRNA介导胰岛素样生长因子（Insulin-like growth factor，IGFⅠ）及其受体IGFIR基因沉默时，鹿茸干细胞端粒酶活性的变化；探讨IGFⅠ、IGFⅠR与端粒酶活性之间的关系。由此，我们推测鹿茸干细胞的永生化能力和端粒酶活性是否具有相关性，IGFⅠ和端粒酶在鹿茸的生长规律和再生调节机制等方面可能具有的重大意义。可见，这是一项现实的有重要意义的研究课题。

鹿茸再生是生物学种的奥秘，它是研究再生基本过程的一个天然模型。如果能够了解这种机制，对人类健康、人类组织和器官工程有很大的意义。MicroRNA是新近证明的一类高度保守的、内源性非蛋白编码的长度约为20~25nt的小分子RNA，在转录后水平调节基因的表达。越来越多的研究显示，MicroRNAs 参与细胞生长发育，在生物体发育过程中起重要的调控作用。目前在鹿茸发育生物学研究中尚无microRNA技术应用的报道，通过microRNA技术开展鹿茸再生调控的研究成为可行的途径。因此，本研究以鹿茸顶端组织为体外研究对象，首先初步建立鹿茸间充质干细胞体外培养方法，以此为基础，利用MTT法和流式细胞仪对鹿茸细胞的增值能力进行分析，通过TRAP银染法对鹿茸顶端组织不同部位端粒酶活性和不同培养代数鹿茸干细胞的端粒酶活性进行了检测，发现鹿茸干细胞始终保持较高水平的端粒酶活性。利用分子生物学手段对鹿茸IGF1及其受体IGF1R基因的克隆进行研究。又利用Real time PCR方法对梅花鹿IGF1及其受体基因在鹿茸顶端不同组织进行了相对荧光定量表达分析。通过数据分析显示，IGF1及其受体基因在不同组织部位均有表达。在以上研究的基础上，结合生物信息学技术和鹿茸组织microRNA芯片测序结果，通过microRNA干扰基因表达的方式对鹿茸IGF1及其受体进行基因沉默的研究。结果表明：鹿茸干细胞的增殖受到抑制，细胞周期中各期细胞数的百分比有所改变，G0期细胞数增加，S期细胞数减少；与对照组比较，鹿茸细胞端粒酶活性降低；Western blotting分析IGF1及其受体的蛋白表达水平有所下降，且呈时间依赖性。本研究进一步发现在鹿茸快速生长期IGF1及其受体的作用较大，也更加验证IGF1是鹿茸再生过程中的主效因子之一，并提示IGF1的表达与端粒酶活性有一定的关系，预示鹿茸的再生发育与端粒酶活性具有相关性；同时我们从RNA组学的角度初次发现在鹿茸细胞的快速生长过程中受到miRNA的调控，这些新发现为我们后续研究奠定了良好的基础，有望为阐明鹿茸再生调控的分子机理提供可供参考和利用的基础实验依据。