基于肝多巴胺受体途径的硫酸转移酶诱导机理的研究

硫酸转移酶(SULT)参与体内重要内源性物质激素、神经递质等的代谢，是重要的药物代谢II相酶，研究其调控机理具有重要意义。基于激素对SULT调节的核受体途径的机理研究已日渐完善，而多巴胺等神经递质对SULT调节的研究尚属空白。本课题在已有工作基础上， 将(1)确定肝细胞及大鼠肝中多巴胺受体(DR)表达的主要亚型并比较差异；(2)采用生物学功能增加与缺失策略，利用Western blot、实时PCR、转基因表达、RNA干扰、基因敲除等技术，考察DR激动和拮抗对肝细胞和大鼠肝中SULT的影响。初步探明基于肝DR途径的SULT调控机理；(3)以扑热息痛和莫西沙星为探针药对该机理进行体内验证。课题将揭示DR新的生理学功能和新的基于DR途径的SULT诱导机理，对进一步探明涉及CNS药物及SULT的药物代谢、药物-药物相互作用和合理用药提供依据; 将大大丰富药物代谢酶调控机理的研究内容。

本课题主要完成了以下几个方面的工作：. 1. Western blot、Real-time PCR、免疫组化及免疫荧光等多种方法证实了多巴胺受体(DR)各亚型(D1-D5)在肝细胞及大鼠肝中有表达，其中D1表达强于D2。. 2. 体外实验发现D1激动剂可增加HepG2细胞中SULT三个亚型(1A1、2A1和1E1)的活性，D1抑制剂不影响SULTs活性；D2途径对SULT的诱导作用弱且规律性不强。发现特D1特异性激动剂能显著诱导D1，且选择性诱导2A1的mRNA和蛋白表达，对1A1和1E1的影响则显著小于2A1。通过选择D1激动剂与其特异性受体抑制剂联用及基因干扰实验，进一步证实了2A1的诱导与D1激动直接相关，初步说明了2A1基于D1激动的诱导机理。. 3. Western blot、Real-time PCR及酶活性测定的体内实验结果显示DA可显著诱导雄性和雌性大鼠肝脏中的2A1和1A1，对1E1没有影响。而L-DOPA对SULT各亚型的影响不同于DA的作用，且显示性别差异。作用于CNS的甲基苯丙胺(METH)对肝脏及脑中不同部位的SULT也有不同程度的诱导。这些结果说明CNS和肝中的DR激动表现出不同的SULT调节作用。免疫荧光结果则表明DA对大鼠肝中DR作用以D1激动为主，说明了肝中D1激动主导了SULT的诱导。. 4. 基于体内外结果，我们以2A1底物莫西沙星(MOX)为模型药，建立了测定MOX及其硫酸化代谢产物(SUL-MOX)血浆浓度的HPLC及LC/MS方法，考察了给与DA对大鼠MOX及SUL-MOX药动学的影响，发现给与DA可使MOX的AUC明显下降，SUL-MOX的AUC却显著增高。此结果是DR激动致使肝SULT2A1诱导的体内验证。. 总之，上述体内外研究结果说明DR在肝脏是有表达的，且肝中DR(特别是D1)的激动可引起SULT(特别是2A1)的诱导，说明了DR在肝脏具有调控代谢酶表达的功能。课题内容按计划如期完成，并初步证明了课题的最初假设。目前已经发表SCI论文2篇，另有1篇SCI论文在修改中，还有2篇论文正在整理结果和撰写中，预计总共可发表5篇论文，可完成预期目标；课题部分内容在2013年北京地区DMPK会议上作了大会报告。