多孔型种植体CKIP-1 siRNA缓释涂层的构建及生物学效应的研究

CKIP-1 regulates the osteogenic differentiation negatively. However, the effects of transfection of CKIP-1 siRNA in situ around the implant on osteoblast and bone formation are not clear. This study aims to evaluate the the targeting and the transfection efficacy of RGD and TAT -grafted siRNA-CaPNPS vectors on cellular and molecular level, explore the effects of transfection of siRNA on CKIP-1 gene silencing in BMSCs and osteoblast, and regulate the osteogenic differentiation through preparing siRNA-CaPNPs-RGD -TAT vectors system with CaPNPs as the core. Porous implants coated by Poly-(L-lysine)（PLL）and siRNA vectors are prepared by LbL technology. On both the cellular and molecular level, their sustained-releasing properties and the effects on BMSCs and osteoblasts are evaluated, also with the biological safety of the siRNA carrier coating on animal level. This study aims to explore the effects of release and transfection of siRNA in situ around the implant on the osteointegration, and explain the regulatory mechanisms of the osteoblasts and the osteointegration by the transfection of CKIP-1 siRNA in situ, so as to provide theoretical guideline for fabricating gene functional implants.

CKIP-1具有负调控成骨分化的作用，在种植体周原位转染CKIP-1 siRNA对骨形成细胞功能和骨整合形成的调控作用尚不清楚。本课题以CaPNPs为核，构建siRNA-CaPNPs-RGD-TAT载体系统，从细胞和分子水平评价接枝RGD与TAT对siRNA-CaPNPS 载体的靶向性和转染效率的影响，探讨siRNA转染对BMSCs和成骨细胞内CKIP-1的基因沉默作用和成骨分化的调控作用；然后用LbL技术在多孔型种植体表层制备多聚赖氨酸（PLL）与siRNA载体涂层，在细胞和分子水平评价PLL与CKIP-1 siRNA载体涂层的缓释特性和对BMSCs和成骨细胞功能的影响，在动物水平评价siRNA载体涂层的生物安全性，探讨siRNA在种植体周原位释放和转染对骨整合形成的影响，阐述CKIP-1 siRNA原位转染对骨形成细胞和骨整合的调控机制，为构建基因功能化种植体提供理论指导。

现有的致密型牙种植体存在生物活性差，骨整合形成时间长、力学性能与周围骨质不匹配等不足，因此提高种植体表面生物活性是必要的。CKIP-1具有负调控成骨分化的作用，本项目以CKIP-1 siRNA沉默CKIP-1表达，探讨多孔钛种植体周原位转染CKIP-1 siRNA对骨形成细胞功能和骨整合形成的调控作用。在前期研究的基础上，本项目制备了一种局部缓释CKIP-1 siRNA的多孔钛种植体，从细胞和分子水平评价了siRNA载体的靶向性和转染效率，及其对MG63细胞功能的影响，探讨了CKIP-1 siRNA转染对MG63细胞功能的影响及可能机制；通过体内植入实验评价了改性的多孔钛种植体的多孔结构因素对新骨生成和骨整合的影响，探讨了局部缓释CKIP-1 siRNA对新骨生成的调控的可能机制。研究发现用共注射成形技术可以制备外层多孔内芯致密，且二者稳定结合的钛种植体。接枝RGD和TAT的CaPNPs具有膜靶向性和促进细胞的胞吞作用；LBL法制备的PLL-CaPNPS-RGD-TAT-siRNA涂层具有局部缓释功能，且转染CKIP-1 siRNA可促进MG63分化，并上调OC、Col-Ⅰ及OPN基因的表达。体内植入实验发现，多孔层具有孔隙率50%以上、孔径50-300μm的连通结构时，植体有利于血管和骨组织长入孔隙；CaPNPs-siRNA缓释涂层的多孔种植体可局部缓释CKIP-1 siRNA，因此有利于新骨生成和早期骨整合形成。本研究首次设计并制备了一种新型的基因功能化多孔种植体，系统地研究了多孔层结构因素对骨组织长入孔隙的影响，及转染局部缓释CKIP-1 siRNA对骨整合形成的调控机制，为研发基因功能化钛种植体提供理论指导，为具有自主知识产权的多孔种植体制备提供了理论基础和初步的试制。