细胞自噬在狂犬病病毒感染中的作用及调控机制研究

Rabies, caused by rabies virus (RABV), is one of the most important zoonotic diseases, The pathogenesis and immune-evasion mechanism of RABV remain unclear, hence there is no effective treatment for rabies, and the mortality rate is almost 100%.Pathological lesions and immune response in the central nervous system caused by attenuated RABV or wild-type RABV strain are significantly different. Recent study demonstrated that for a variety of viruses, autophagy played important roles in viral infection, replication, pathogenicity and immune response, however, the relationship between autophagy and RABV remains unknown. In this project we intends to use murine neuron to study the mechanism of autophagy induced by attenuated or wild-type RABV and the roles autophagy plays in the infection and replication of both viruses; also we will analyze the autophagy-related gene expression and signal pathway. In addition, we will use mouse to study the effects of autophagy to the replication, pathogenicity and immune response of these two viruses in vivo, and unravel the interaction between autophagy and RABV. The results of these studies will provide important insights into the pathogenesis and immune-evasion of RABV, and open up new avenue for development of novel medicine.

狂犬病是由狂犬病病毒引起的一种重要人兽共患传染病。由于狂犬病病毒的致病和免疫逃避机制不详，导致发病后无有效治疗措施，病死率几乎为100%。狂犬病病毒弱毒株和街毒株在中枢神经系统引起的病理损伤和免疫反应差异很大。研究发现，细胞自噬在多种病毒的感染、复制、致病力和免疫反应方面发挥重要作用，但是尚不清楚细胞自噬与狂犬病病毒的相互关系。本项目拟以小鼠源神经细胞为模式细胞，研究狂犬病病毒弱毒株和街毒株能否诱导细胞自噬，自噬在两种病毒感染和复制中的作用，以及分析自噬相关基因的表达和信号通路。拟以小鼠为模式动物，研究自噬在小鼠体内对狂犬病病毒弱毒株和街毒株的复制、致病力和免疫应答的影响，探究自噬与两种病毒相互作用的差异和调控机制。为进一步揭示狂犬病病毒的致病和免疫逃逸机制及开发新型抗病毒药物提供新的线索。

对RABV的研究已逾百年，但关于其致病机理仍无明确定论。有关RABV与宿主细胞相互作用方面的了解还很有限，特别是RABV感染后引起的宿主蛋白质整体变化水平及与之相关的失调的生物学功能整体研究进展较为缓慢。自噬是机体进化保守的一种胞内降解途径，能够将衰老的细胞器、有害的蛋白聚集体、错误折叠蛋白等包裹至自噬体中，并通过与溶酶体融合实现内容物的降解。在我们的课题开始之初尚无RABV与自噬相互作用的报道，因此研究二者关系可为解析RABV致病机理提供重要依据。该项目分为两部分进行研究：一、RABV感染诱导NA细胞自噬。该部分实验中，选取小鼠神经瘤细胞（mouse neuroblastoma cell line，NA）为体外模型，通过透射电镜观察自噬体的超微结构、荧光显微镜观察EGFP-LC3以及mRFP-GFP-LC3荧光斑点的聚集情况，并联合应用western blot方法检测自噬标记分子LC3-II和自噬底物p62的表达量等多种手段评估RABV强、弱毒株感染后NA细胞的自噬水平。结果显示，RABV感染NA细胞后，胞内自噬体数量明显增多，且实验室致弱毒株SRV9诱导的自噬体的增多明显高于标准攻击毒株CVS-11株。综上所述，RABV感染可以诱导自噬，且强、弱毒株之间存在差异。二、细胞自噬对RABV小鼠体内复制的影响。首先利用CCK-8试剂盒方法测定自噬调节剂处理后NA细胞的活性及利用RABV内化实验测定自噬调节剂对RABV内化速率的影响，从而筛选出适用的自噬激动剂及抑制剂。接下来在RABV感染过程中以自噬调剂剂处理NA细胞，测定自噬活性改变对RABV复制的影响。此外，为排除药物本身对细胞其他方面的影响，利用shRNA对自噬关键基因Beclin 1进行沉默后检测下调自噬水平对RABV复制的影响。结果显示，调剂细胞自噬对RABV在NA细胞上复制无影响。另外，该部分实验亦对自噬调节剂对RABV在小鼠脑组织内复制的影响及对小鼠的致病毒性进行检测。体内实验结果表明，自噬激动剂可以在不影响病毒复制的情况下增加RABV对小鼠的致死性。