两种抗菌素中稀有L-别异亮氨酸结构单元生物合成酶的结构与催化机理研究

Natural cydicpeptide ususally shows important medicinal values. The special unnatural amino acids unit within it, i.e., L-allo-isoleucine, plays significant role in maintaining the medicinal activity. Currently, there is no report on the biosynthesis of L-allo-isoleucine. We recently found the L-allo-isoleucine unit of antibacterial cyclic peptides desotamides and marformycins are biosysthesized by synergistic catalysis of aminotransferase and isomerase. However, the detailed catalytic mechanism are not clear yet. The catalytic mechanism of L-allo-isoleucine in atomic and molecular level was carried on by using X- ray crystallography and biochemical technique in this project. The main contents are as follow: 1) To obtain the apo-protein and complex crystals of aminotransferase and isomerase, and then clarify the structure.2) To conform the key amino acid residue in case of enzyme recognizing substrate and catalysis, and elucidate the synthase catalytic mechanism. 3) To propose the catalytic model of aminotransferase and isomerase, according to the 3-D structural data and the interaction process. Thus, the work in this project will contribute to the understanding of the biosynthesis mechanism of L-allo-isoleucine, and development of biocatalyst and novel peptide drugs.

多肽类活性天然产物具有重要的药用价值，其中的非天然氨基酸结构单元对维持药用活性具有显著作用。L-别异亮氨酸是多肽天然活性化合物稀有结构单元。目前，没有L-别异亮氨酸结构单元生物合成酶的研究报道。我们前期研究发现抗菌环肽desotamides和marformycins中L-别异亮氨酸由氨基转移酶（DsaD和MfnH）与异构酶（DsaE和MfnO）协同催化生成，其三维结构和催化机理尚不清楚。本项目拟运用X-射线晶体学，辅助生化手段，从原子分子水平研究L-别异亮氨酸的酶催化机制。期望：1）获得氨基转移酶、异构酶脱底物及复合物晶体，解析三维结构；2）明确两酶参与底物识别与催化的关键残基，阐明酶催化的分子机理；3）根据三维结构数据及两种酶互作方式，提出催化过程的分子模型。本项目的开展，有助于精确认识L-别异亮氨酸的生物合成机制，为酶类生物催化剂开发、多肽类先导化合物改造及新药开发提供理论和技术支撑。

多肽类活性天然产物具有重要的药用价值，其中非天然氨基酸结构单元，对维持其药用活性具有显著作用。L-别异亮氨酸是多肽天然活性化合物稀有结构单元。项目立项前没有任何针对L-别异亮氨酸结构单元生物合成酶的研究报道。我们前期研究发现抗菌环肽desotamides和marformycins中L-别异亮氨酸由转氨酶（DsaD和MfnH）与异构酶（DsaE和MfnO）协同催化生成，但其三维结构和催化机理尚不清楚。本项目针对L-别异亮氨酸生物合成相关的转氨酶与异构酶，开展了酶结构与功能研究。1）通过构建大肠杆菌表达载体，建立4种酶的高效表达纯化策略，开展了酶功能及酶动力学研究；2）解析2种异构酶MfnH和DsaE的高分辨率三维结构，获得1种氨基转移酶MfnO的可结晶条件；3）通过氨基酸同源性、结构分析，确定两酶参与底物识别与催化的关键残基，基本阐明酶催化的分子机理；此外项目开展期间，4）研究了异构酶家族另外2个新颖酶MtdL和Hyg20，首次经体外酶活证实该两酶可催化GDP-β-L-Fucp 到 GDP-α-L-Fucf 的互变，为L-呋喃岩藻糖生物合成所必须，进一步扩展了我们对这一系列异构酶的了解，为利用温和酶法制备L-呋喃岩藻糖提供了新思路； 5）同时，利用单晶衍射技术及其他相关结构表征技术，开展了部分天然活性产物结构修饰与合成方面的研究工作，解析多个天然药用化合物的单晶结构。项目开展期间发表基金标注SCI论文2篇，其中1区TOP第一作者论文1篇，通讯作者1篇，正在整理和撰写研究论文2篇，计划两年内见刊；授权发明专利3项；参与培养博士1名，硕士2名，学士1名；获得1项广东省自然科学基金自由项目资助。 综上所述，本项目开展期间成功解析了新颖异构酶MfnH及DsaE的高分辨率三维结构，有助于精确认识异构酶与氨基转移酶协同催化L-别异亮氨酸生物合成的酶机制，为后续开展该家族异构酶的结构和功能提供了可参照的同源模型，可有效提升解析该家族其他异构酶三维结构效率，为酶类生物催化剂的开发、多肽类先导化合物的改造及其新药的开发提供理论和技术支撑。