FIP200介导自噬调控白血病细胞化疗耐药的机制研究

如何克服白血病细胞化疗耐药是目前全球亟待解决的问题。研究发现自噬在肿瘤细胞发生发展及化学药物治疗中发挥重要作用。FIP200是一种与粘着斑激酶家族相互作用的蛋白，可介导细胞自噬发生。现我们提出"FIP200介导自噬调控白血病细胞化疗耐药"的科学假说。本课题拟应用白血病细胞株，通过RNA干扰技术沉默FIP200基因表达，分别在营养状态及饥饿状态下，进行白血病细胞凋亡、自噬及其分子信号通路检测，明确FIP200在白血病细胞自噬过程的作用。体外应用哺乳动物雷帕霉素靶蛋白抑制剂或酪氨酸激酶抑制剂处理白血病细胞，研究FIP200介导自噬在白血病细胞化疗耐药的机制；同时建立白血病动物模型，研究FIP200基因沉默联合化疗药物对白血病生成的影响。本课题以FIP200为研究靶点，通过体外实验及动物体内实验，深入探讨自噬在白血病细胞化疗耐药的作用机制，为临床治疗白血病提供新思路。

本研究项目开展自噬对白血病细胞化疗耐药的调控机制研究，明确FIP200（focal adhesion kinase family interacting protein of 200kD）介导自噬在白血病细胞化疗耐药过程的作用及分子机制。（1）我们成功构建慢病毒载体 FIP200 shRNA，证实该FIP200 shRNA 能有效沉默FIP200基因表达。将REH白血病细胞置于培养基中，体外应用Hoechst荧光标记，流式细胞仪检测，结果发现与空白载体相比，FIP200 基因沉默能促进白血病细胞凋亡的发生。应用Western blot方法检测白血病细胞 LC3-I、LC3-II、Benclin 1等，应用电镜观察以评价细胞自噬的形成，结果发现FIP200基因沉默可抑制白血病自噬的发生。（2）体外应用不同浓度的化疗药物处理白血病细胞，收集细胞进行耐药性及自噬水平检测、自噬分子信号通路检测等，结果发现FIP200基因沉默组细胞凋亡率明显高于空白对照组。将REH白血病细胞经尾静脉注射到SCID小鼠体内，成功建立REH细胞－SCID小鼠模型。将化疗药物经腹腔注射到白血病动物模型，结果发现联合化疗药物与FIP200基因沉默的小鼠生存时间明显延长，提示联合FIP200基因沉默能增强白血病细胞对化疗药物的敏感性。（3）应用免疫共沉淀技术检测ULK1-Atg13-FIP200 复合物、Beclin1-HMGB1复合物形成情况，进行细胞活性及耐药性检测，结果发现ULK1-Atg13-FIP200 复合物位于Beclin1-HMGB1复合物的上游。予特异性抗体抑制ERK和JNK磷酸化通路，通过Western blot检测Bcl-2、ERK、JNK磷酸化水平，免疫共沉淀法检测Beclin1-HMGB1复合物形成情况，结果发现FIP200通过ERK、JNK途径使Bcl-2磷酸化，介导Beclin1-HMGB1复合物形成。予丙酮酸乙酯抑制HMGB1转位，核浆分离法分别提取核蛋白和胞浆蛋白，通过Western blot及免疫荧光检测HMGB1转位水平，结果发现FIP200通过使HMGB1从胞核转位至胞浆，介导Beclin1-HMGB1复合物形成，从而影响下游自噬介导的白血病细胞化疗耐药。