月季花香相关基因RhMYB的克隆及功能分析

月季花香特性不仅具有重要的生物学意义，而且具有重要的观赏性状和商业价值，由于花香难以定量定性测定、缺少合适的突变体、月季花香代谢路径复杂等原因，限制了通过遗传改良来培育具有香味的月季品种。项目组在前期的研究中从有香味的'金银岛'中发现了无香味的突变体'往日情怀'，并构建了花香相关SSH cDNA文库，明确了和月季香味相关的SCAR标记，发现RhMYB的同源基因在香型月季特异表达，本项目在已有的研究基础上，采用RACE技术，进一步获得RhMYB基因的全长；随后通过Northern blot及实时定量RT-PCR方法进行该基因表达谱分析；最后构建该基因的高表达及高抑制载体，转化月季愈伤组织，获得转基因植株。此研究结果不仅有助于探明月季转录因子家族MYB类基因在花香调控中的作用，而且为利用转基因技术培育具有香味的月季品种提供候选基因。

月季的花香是重要的观赏性状，同时具有重要的生物学意义和商业价值。增加香味是目前月季育种的热点。项目组在前期的研究中从浓香型月季‘金银岛’中发现了无香味的突变体‘往日情怀’，并构建了月季花香相关SSH cDNA文库，发现RhMYB基因在‘金银岛’中特异表达。本项目在已有的研究基础上，采用RACE技术，克隆了RhMYB基因的全长cDNA；对RhMYB表达谱进行了Northern blot及实时定量RT-PCR分析；构建表达载体，转化月季愈伤，对RhMYB基因的功能进行分析。结果如下：1）RhMYB基因有1125 bp，包含一个882bp 的ORF框和1 个MYB 结构域，GenBank登录号为Eu082130。2）Northern blot及实时定量RT-PCR对RhMYB基因的表达谱分析发现RhMYB在‘金银岛’的花瓣中特异表达，而在茎和叶中均无表达； ‘金银岛’ 花朵6个不同发育时期中的RhMYB表达谱显示，RhMYB在第一时期即花蕾期表达量较低，随着花朵的开放，表达量逐渐增加，到第4期时该基因表达量达到最强，随后随着花朵的凋谢，RhMYB表达量也逐渐降低，表现出和花香的释放呈现一定的规律。3）将RhMYB基因及相应的反义cDNA通过酶切、连接、转化等构建了以35S为启动子的高表达载体pOCA30-RhMYB及相应的抑制载体。4）建立 ‘往日情怀’及古老月季‘月月粉’胚性愈伤组织及再生体系，‘往日情怀’胚性愈伤诱导培养基为MS+TDZ 4.0 mg•L-1 +GA3 1.0 mg•L-1+NAA 0.1 mg•L-1，暗培养时间4个月，体胚诱导率为21.3%；月月粉胚性愈伤组织诱导培养基为MS+2,4-D 3 mg•L-1+6-BA 0.01 mg•L-1+AgNo3 5 mg•L-1，暗培养四个月体胚诱导率为35.6%。5）获得了转基因RhMYB月季小苗52株；同时获得了转基因RhMYB矮牵牛68株，对矮牵牛的花朵进行成分分析发现 1-乙烯基-4-加氧基苯是转基因植株增加的主要香味成分。综上，项目克隆了RhMYB基因，通过表达谱分析，发现RhMYB基因参与花香的调控；构建了月季和矮牵牛转化体系，基本探明了RhMYB基因参与调控的香味物质；研究结果不仅探明了月季转录因子RhMYB参与花香调控，为利用转基因技术培育有香味的月季品种提供候选基因。