TLR-RIP1/3-MLKL介导的死亡通路在牙周炎发病过程中的免疫调节作用

In the process of periodontitis development, the immune response to periodontal pathogens, such as Porphyromonas gingivalis, is one important cause of attachment loss. Basic researches have demonstrated that except for apoptosis, other forms of regulated cell death, most importantly the necroptosis (NP), are also present in host defense cells in response to various pathogens. However, in the periodontal niche, the role of regulated cell death, especially NP, has never been explored. Regarding the above-mentioned information, we hypothesized that via the Toll like receptor pathway, P.gingivalis may activate the formation of the necrosome, which is composed of RIP1, RIP3 and MLKL, leading to the death of host defense cells, release of large amounts of death associated molecule pattern (DAMPs) and periodontal tissue destruction. Human inflamed periodontal tissue, periodontitis animal model and cell culture in vitro model will be employed to unravel the role of TLR-RIP1/3-MLKL mediated necroptosis in the progression of periodontal diseases. Molecular techniques such as lentivirus vector construction and gene interference in the study. Our study may provide new insights into the control of periodontitis.

在牙周炎发病过程中，宿主防御细胞应答牙周致病菌，如牙龈卟啉单胞菌（P.gingivalis），而产生的免疫反应是附着丧失的重要原因。基础研究表明，除凋亡以外，病原微生物刺激宿主防御细胞，形成多种形式的可调控性死亡，如坏死性凋亡（necroptosis，NP）。在牙周微环境中，以NP为代表的可调控性死亡扮演了何种作用，现在缺乏了解。据此，我们提出如下假设：P.gingvalis通过TLR通路，激活RIP1、RIP3和MLKL形成的坏死复合物necrosome，导致宿主防御细胞死亡，释放大量死亡相关分子型（DAMPs），造成牙周组织严重破坏；调控NP可能有利于控制牙周炎进展。本研究拟通过人炎症牙周组织、牙周炎动物模型和细胞体外培养等多个层面，利用病毒载体构建和基因干扰等分子生物学技术，深入分析TLR-RIP1/3-MLKL介导的死亡通路在牙周病进展过程中的作用，从而为牙周炎控制提供新的思路。

在牙周炎发病过程中，病原微生物刺激宿主防御细胞，形成多种形式的可调控性死亡，如坏死性凋亡（necroptosis，NP）。本研究的目的是深入分析TLR-RIP1/3-MLKL介导的死亡通路在牙周病进展过程中的作用，从而为牙周炎控制提供新的思路。. 本项目中，在未经治疗的慢性牙周炎患者的牙龈组织中观察到受体相互作用蛋白丝氨酸苏氨酸激酶-1（RIPK1）、磷酸化RIPK3、混合谱系激酶结构域样蛋白（MLKL）、磷酸化MLKL、基因转录调控相关基因拓扑异构酶1、溴区结构域额外末端蛋白和细胞周期蛋白依赖性激酶9（cyclin-dependent kinase 9, CDK9）和FLIPL蛋白的高表达；其中以CDK9的表达最为明显，而caspase8在牙周炎组和健康对照组之间无差异。P. gingivalis（MOI=100）可以引起单核细胞发生坏死性凋亡，但在PDLFs中P. gingivalis以MOI=400刺激可引起坏死性凋亡。反复冻融单核细胞制备DAMPs，DAMPs可以增强PDLFs对P. gingivalis的免疫反应；此外，DAMPs本身可触发PDLFs发生RIPK1、RIPK3和MLKL介导的坏死性细胞凋亡；这些结果表明，RIPK3和MLKL介导的坏死性凋亡参与了牙周炎的发病机制。P. gingivalis刺激人体免疫细胞单核细胞后，采用flavopiridol抑制CDK9，结果显示P. gingivalis 诱导的炎症细胞因子TNF-α和IL-6的表达受到抑制。此外，necroptosis的发生也明显减少。采用CDK9 shRNA慢病毒干扰CDK9后，我们也观察到了necroptosis的发生受到抑制，这提示我们抑制CDK9能够有效抑制炎症和necroptosis。动物实验结果，我们发现necroptosis相关重要分子MLKL的抑制剂NSA可以有效降低细菌引起的牙槽骨吸收，提高机体对细菌清除的效果，而抑制CDK9能够减少 P. gingivalis的增殖，抑制炎症因子的释放，减少necroptosis的发生，减轻牙周组织的损伤并进一步延缓牙周炎的进展。因此通过调节RIPK3 - MLKL介导的坏死和调节CDK9作为控制牙周病的新方向，从而深入研究necroptosis在牙周病中的免疫学作用，为牙周病的临床治疗提供新思路。