Incarvine C作为新型ROCK2抑制剂的发现以及调控肝癌血管化拟态形成的机制研究

Our results have demonstrated that ROCK is involved in vasculogenic mimicry (VM) formation in hepatocellular carcinoma (HCC), and Incarvine C (IVC) potentially regulates ROCK function, but the molecular mechanisms of IVC effecting ROCK in VM is not elucidated. We have found that ROCK2 inhibition decreased VM formation, tumor size and expression of VM key factors cell in vitro and in vivo in HCC campared with ROCK1 inhibition, indicated that ROCK2 plays an essential role in VM formation. Moreover, inhibition of ROCK2 resulted in a decreased proliferation, similar to effect of IVC on HCC cells, whereas inhibition of ROCK1 had the opposite effect; Besides, results of SPR showed that IVC combined with ROCK2 in a dose-dependent manner (KD=10.1μm), suggested that IVC mediates VM formation involving ROCK2. To confirm this hypothesis, this project intends to investigate combination of IVC and ROCK2, and explore molecular mechanism of IVC on ROCK2 in formation of VM in HCC.

课题组已经证实Rho激酶 (ROCK) 参与血管化拟态 (VM) 形成，而小分子化合物Incarvine C (IVC)具有潜在的调控ROCK作用，但IVC如何调控ROCK参与VM形成的机制还未完全阐明。前期实验结果显示，与沉默ROCK1比较，沉默ROCK2体内外明显抑制VM形成，瘤体生长以及VM关键因子的表达，推测ROCK2是调控VM形成的关键；研究表明抑制ROCK2抗细胞增殖而抑制ROCK1结果相反，而IVC具有和ROCK2类似的抗增殖作用；前期等表面等离子共振(SPR)技术显示IVC与ROCK2呈现剂量依赖关系（KD=10.1μm），推断可能IVC直接调控ROCK2参与VM形成。据此本项目欲从肝癌样本找到ROCK2与VM的关系，双向调节ROCK2检测VM变化，阐明ROCK2的关键调节作用，以及IVC与ROCK2的结合模式，最终揭示IVC作为ROCK2抑制剂参与调控VM形成的分子机制。

肝细胞癌（Hepatocellular carcinoma, HCC）是临床最常见的恶性肿瘤之一, 其发病率在全球癌症中排名第六。目前临床治疗肝癌的化疗药物耐药性显著，导致晚期HCC患者预后差，死亡率极高。扁柏双黄酮 (Hinokiflavone, HF)，是从天然植物卷柏Selaginellatamariscina (P. Beauv.) Spring中提取分离出来的双黄酮类化合物。迄今为止，尚未有文献报道HF具有抗HCC的活性。扁柏双黄酮能够显著抑制HCC细胞增殖，诱导G0/G1期细胞周期阻滞。扁柏双黄酮通过抑制NF-κB信号传导，并激活线粒体衍生ROS/JNK信号通路，诱导HCC细胞caspase依赖性的细胞凋亡。 体内Western blot和免疫组化的检测结果显示，相对于对照组，给药组肿瘤组织表达的cleaved-PARP、cleaved-caspase 3和p-JNK蛋白表达水平明显升高，然而p-IκBα和p-p65却有所下降，与体外细胞实验的结果相符合。同时安全性评价显示，对照组和给药组小鼠的心脏，肝脏，脾脏，肺和肾脏组织的HE染色结果并无显著差异。扁柏双黄酮能够显著抑制肿瘤的生长，可作为一种潜在的低毒、有效的抗肝细胞癌的先导化合物。..本课题组前期探讨了ROCKs参与调控肝癌的发生发展，但是Long non-coding RNA是否参与调控这一过程；亦或者，LncRNA是否通过别的途径介导了ROCK调控肝癌的恶性变尚未阐明。因此本课题组通过RNA芯片高通量测序在这方面做一些初步探索。本课题组构建ROCK1和ROCK2过表达的MHCC-97H细胞株。通过RNA芯片高通量测序测定ROCK1和ROCK2分别调控下游哪些LncRNA; GO分析富集差异表达LncRNA所参与的生物学途径； KEGG分析富集差异表达 的LncRNA参与调控的信号通路。ROCK1、2下游LncRNA与mRNA的相互作用网络揭示了一些重要的节点分子，为进一步研究提供思路和基础。在此基础上，通过qPCR验证芯片结果，精准分析特定分子的表达变化情况。