sRNA伴侣蛋白Hfq与sRNA RsmY对藤黄绿菌素合成途径转录激活子PltR表达的转录后调控机制

Pyoluteorin (Plt) is a broad-spectrum antifungal antibiotic produced by rhizosphere biocontrol Pseudomonas. Our extesive in-depth studies have shown that a unique and complex regulatory networks control Plt biosynthesis in Pseudomonas strain M18. The sRNA chaperone Hfq, at the post-transcriptional level, was shown to strongly down-regulate expression of the plt transcriptional activator PltR, however, the underlying molecular mechanism remains unknown. Also, the sRNA RsmY was found to post-transcriptionally activate the pltR expression; however, these remain unclear the activation pathway and mechanism by which RsmY controls the pltR expression and whether the sRNA RsmY is directly correlated with the sRNA chaperone Hfq in the regulation on pltR expression. In this study, through gene mutation or over-expression, lacZ report analysis, RT-PCR, Co-IP (Co-immunoprecipitation), northern blotting, RNA-seq (RNA sequecing), EMSA (Electrophoretic mobility shift assay), footprinting analysis, SPR (Surface plasmon resonance) technology, etc., we will study: (1) molecular mechanism by which Hfq, alone or in incollaboration with sRNA, reugulates on the pltR expression; (2) the interaction mechanism between the sRNA chaperone Hfq and the sRNA RsmY in the regulation of pltR expression; (3) comparison of target sites and regulatoy mechanism between the RsmY-binding downstream translational repressors RsmA and Hfq on the pltR mRNA. This study will lay the foundation for clarifying the post-transcriptional regulatory pathway and mechanism of Plt biosynthesis and exploring the connection between the sRNA-mediated antisense regulation and the sRNA-mediated gene regulation by sequestering regulatory proteins.

藤黄绿菌素（Plt）是根际假单胞菌合成的一种广谱抗真菌抗生素。课题组前期研究表明，在假单胞菌株M18中存在独特而复杂的Plt合成调控网络。其中，在转录后水平，sRNA伴侣蛋白Hfq强烈负调控plt转录激活子PltR的表达，然而分子机理尚不清楚；sRNA RsmY转录后激活pltR表达，然而，RsmY对pltR的激活途径及机制，RsmY与Hfq在pltR表达调控中的相关性，均不清楚。本项目拟运用基因突变与过表达、lacZ报告分析、RT-PCR、Co-IP、RNA-seq、EMSA、足迹分析、SPR等技术，研究Hfq独自或协助其它反义sRNA对pltR负调控的分子机制；分析Hfq与RsmY的相互作用机制；比较研究RsmY结合的下游翻译阻遏蛋白RsmA与Hfq在pltR mRNA上的调控位点及机制。为阐明Plt合成的转录后调控通路奠定基础，探索sRNA的反义调控机制与结合调控蛋白机制之间的联系。

藤黄绿菌素（Pyoluteorin, Plt）是根际假单胞菌产生的一种PKS-NRPS杂合抗生素，具有较强的抗真菌、抗细菌、除草等广谱活性，特别是能有效抑制植物病原真菌如瓜果腐霉、疫霉和水稻纹枯病菌等。Plt合成基因簇由两对反向转录的操纵子组成，一对为pltLABCDEFG合成操纵子与转录激活子基因pltR，另一对为转运操纵子及调控基因。本课题重点研究了：假单胞菌株H78中Gac/Rsm信号转导系统（由双元系统GacS/A、sRNA RsmY/X/Z、翻译调控蛋白RsmA/E）中RsmY等、RsmA/RsmE对pltR、pltL-G操纵子表达的转录后调控机制；RNA伴侣蛋白Hfq对根际铜绿假单胞菌M18与防御假单胞菌H78 中pltR、pltL-G表达的转录后调控机制的比较研究。旨在阐明Gac/Rsm系统与RNA伴侣蛋白Hfq对Plt合成的复杂调控通路与独特调控机制。项目进展顺利，已完成预定的研究计划与内容。项目系统研究并阐明：① Gac/Rsm调控系统对假单胞菌H78中Plt合成存在三条重要的调控通路：第一条通路为GacS/A→RsmXYZ→ RsmE→ pltR、pltA/B→pltL-G转录后正调控通路，该通路的分子机制已研究阐明；第二条为新发现的由RsmA/E共同驱动的反馈激活回路，即RsmA/E→GacS/A→RsmXYZ →？→plt，其机制有待进一步研究；第三条为RsmA通过未知机制对pltR及pltL-G表达的转录正调控通路。② RNA伴侣Hfq对Plt合成及操纵子表达的调控在假单胞菌H78与M18中，存在激活（H78）与阻遏（M18）完全相反的两种调控机制；两株菌中PltR均介导了Hfq对pltL-G表达的调控，由于两类pltR-pltL非编码区存在同Hfq靶元件，而导致相反调控机制。. 相关研究成果目前已在国际微生物权威期刊《Molecular microbiology》上发表代表性研究论文1篇，在《Applied Microbiology and Biotechnology》等其它国际、国内期刊上共发表论文6篇。另有2篇论文处于审稿阶段，有望近期发表。通过项目实施，共培养研究生5名。课题成果，为阐明Plt合成的调控网络奠定了良好基础，也为其它微生物次级代谢的调控研究提供借鉴。同时为Plt高产的基因及代谢工程提供依据，以促进Plt产业化及应用。