基于三螺旋DNA的免疫-PCR新分析方法研究

Many proteins are biomarker of some cancer and contagious disease， but their concentration is very low at the early period of disease. Therefore, it is of importance to develop supper-sensitive method?for dection of protein on the postgenome era.? The project will detect PCR product by using Ru-dppz complexes as luminescent probe, and the luminescent probe will be further used in immuno-PCR to improve its sensitivity. Different new methods for sequence-specific recognition of dsDNA will be developed based upon triplex formation, then applied it to detect PCR product, further combined with immnuo-PCR, to establish novel immuno-PCR sensor based upon the formation of triplex DNA. The new immuno-PCR sensors will be extended to detect the antigen of different diseases, to develop new methods for ultrasensitive dection of antigen for different diseases.

很多蛋白质是一些癌症和传染性疾病的标志物，而它们的浓度在疾病发展的早期阶段非常低。因此在后基因组时代，建立和发展蛋白质的超高灵敏的检测方法显得极为重要。 本项目拟将荧光探针Ru-dppz配合物类发光探针用于检测PCR产物，并将这些探针用于免疫-PCR分析，提高免疫-PCR技术的灵敏度。探索各种基于三螺旋DNA 形成原理的双螺旋DNA 序列识别分析新方法，并将新方法用于PCR产物检测；进一步与免疫-PCR技术相结合，建立基于三螺旋DNA的免疫-PCR新分析方法。将新建立的免疫-PCR 分析方法推广用于不同疾病抗原的检测，发展和建立不同疾病抗原的高灵敏检测方法。

我们采用二茂铁修饰的分子信标为探针，根据三螺旋DNA的形成原理建立序列识别双螺旋DNA的电化学传感器。与杂交链反应放大(HCR)技术相结合,提高检测双链DNA的灵敏度。将三螺旋DNA的序列识别能力与链置换核酸等温放大技术和核酸内切酶放大技术相结合，分别建立检测SV40病毒和HIV病毒的荧光传感器，为SV40 和HIV病毒的检测提供全新的方法。利用Ag+ 对CGC三碱基体的识别和增稳作用，建立由Ag+/Cysteine调控的基于三螺旋DNA的逻辑门。进一步将HCR放大技术与三螺旋DNA相结合，实现对HCR过程的动态调控。以三螺旋DNA为枢钮，将HCR放大技术和其他放大技术相结合，分别建立循环肿瘤DNA , lef7a miRNA和ATP的比色传感器。利用目标物诱导邻近DNA杂交手段特异性识别目标分子，并通过链置换扩增反应对检测信号循环地进行放大,分别建立链霉亲合素和凝血酶的荧光传感器。基于DNA修饰的银板的分离特性和金纳米粒子放大效应的原子吸收光谱法特异性识别单链DNA。. 我们发明了一种多倍PCR 扩增方法（multi-fold PCR），使每个循环的扩增倍数大于2，突破现有的PCR技术的放大极限。利用聚合酶链式反应（PCR）扩增技术和三螺旋DNA的形成原理，建立了一种基于PCR-免疫的检测凝血酶的荧光检测法，线性范围为1.0×10-12 mol/L - 1.0×10-7 mol/L，检出限为261 fmol/L。根据适配体对凝血酶的特异性识别和GOx对葡萄糖的催化氧化，以2,3-二羟基-3-（4-羟基苯基）丙酸（HPPA）为探针，建立凝血酶的荧光传感器。