水稻矮缩病毒外壳蛋白P2介导的膜融合分子机制和结构生物学基础

有效的病毒侵染最关键的一步是将病毒蛋白及病毒基因组释放到宿主细胞内。有囊膜病毒（如HIV 和流感病毒等）可以通过由融合蛋白（包括I型和II型等）介导的膜融合实现侵染；无囊膜病毒常常通过裂解或打孔来释放它的病毒基因组。包括水稻矮缩病毒（RDV）在内的绝大多数植物病毒和一部分动物病毒属于无囊膜病毒。RDV中的P2蛋白是病毒侵染所必需的，它具有膜融合功能所需的结构域并可以介导昆虫细胞的膜融合。作为一个无囊膜病毒的外壳结构蛋白，P2介导的膜融合在病毒侵染过程中的作用一直不清楚。 本研究将通过蛋白生化和结构生物学的方法和手段，结合细胞生物学的功能分析，深入研究水稻矮缩病毒外壳蛋白P2介导的膜融合的分子和原子机制以及结构生物学基础，从而揭示无囊膜病毒中这一特殊的膜融合蛋白与经典的有囊膜病毒中I型融合蛋白在结构功能上的异同以及在进化上的联系，并探讨病毒在植物和昆虫中穿梭感染这一个普遍现象的分子机制。

无囊膜病毒水稻矮缩病毒（Rice Dwarf Virus, RDV）是跨越动、植物两界的双宿主病毒，可以在叶蝉和水稻体内复制。水稻矮缩病毒的外壳结构蛋白（P2）是病毒侵染水稻和昆虫细胞所必需的蛋白，但其具体功能尚未清楚。本课题从结构和功能两方面对水稻矮缩病毒(RDV)外壳蛋白P2在病毒分别侵染水稻和叶蝉细胞时的作用进行研究。为了研究P2蛋白在RDV侵染水稻中的功能和可能的分子机理，我们通过酵母双杂实验从2周的水稻cDNA文库中鉴定出一系列和P2互作的蛋白质，我们对其中一个关键的互作蛋白OsRFPH2-10进行了系统研究，免疫共沉淀进一步证实了OsRFPH2-10和P2蛋白在水稻中的相互作用。OsRFPH2-10是E3 ubiguitin ligase家族的成员，实验表明它能促进水稻P2蛋白质的降解，对水稻抵抗RDV的早期侵染中起着重要的作用。同时，为了研究P2蛋白在RDV侵染昆虫中的具体功能和分子机理，我们分别从原核和真核哺乳动物系统中成功表达和纯化了P2蛋白的不同片段。通过细胞生物学方法以及体外生物化学的方法证实了P2蛋白的1-786片段可以和叶蝉细胞表面受体直接作用，从而介导病毒侵染的的第一步：吸附。进一步通过P2蛋白pull-down以及质谱的方法，对叶蝉细胞膜上与水稻矮缩病毒(RDV)外壳蛋白P2互作的蛋白进行鉴定，并与叶蝉转录组数据结合分析，得到了8个可能与P2互作的受体蛋白。目前正在对这8个叶蝉细胞中的膜受体以及它们和RDV的P2蛋白的相互作用进行进一步的分析和验证。P2蛋白在RDV感染水稻或者叶蝉细胞时可能经历了结构和构象的变化，我们对纯化的P2蛋白在不同条件下进行了蛋白质负染电镜的结构生物学研究，从电镜的原始图片可以看出，P2蛋白的主要聚合方式是三聚，但是也有少量的单体和更高的聚合形式如六聚的出现。对P2蛋白的电镜精细结构研究和构象变化研究正在进行中。