基于标签离子修饰探针的体内抗癌药物靶点EGFR及其信号通路的DESI质谱成像分析方法研究

Mass spectrometry imaging (MSI) has already proved its great advantage in drug’s molecular mechanism research. Due to its high chemical specificity, it can simultaneously provide spatial information both in xenogenous drug and endogenous metabolites. However, MSI is still currently limited in mapping drug target and its correspondent signaling factors, which are not only in close relation with drug action, but also in regulating downstream metabolomics phenotype. In this research project, a tagged ion-modified probe based desorption electrospray ionization (tip-DESI) MSI method will be developed aiming at multiplex analysis of drug target and signaling factors in body. The key technical issue is to design and synthesize a mass tags-modified MSI probe which is bifunctional in specific molecular recognition and ion signal amplification. The probe employs antibody as the recognition unit to localize the drug target by specific interaction. Dendrimer is introduced as the amplification unit by modifying mass tag which has high ionization efficiency. Finally, by off-line or on-line real time cleavage, the dendrimer-bonded mass tags are released, desorbed and ionized into the MS for ion signal readout. Thus, the in situ distribution pattern of the target can be indirectly characterized. It is believed that this tip-DESI MSI must have great application potential in precisely investigating the drug candidate’s molecular targeting effect, evaluating the in-depth pharmacological/toxicological mechanism, and discovering the new indication of clinical drugs.

质谱成像作为一种基于原位电离的高特异性分子影像技术，可同时获取药物、代谢物在体内的空间分布信息，在探究药物分子机制方面有重要应用价值，但在分析药物靶点与信号通路因子方面存在技术局限，而这些靶点及信号通路因子的表达水平与分布，与药物作用分子机制有更直接联系，且对调控下游代谢水平起关键媒介作用。本项目选取抗癌药物靶点EGFR及其信号通路为研究对象，建立一种基于报告离子修饰探针的DESI质谱成像分析方法，对上述生物分子在荷瘤动物体内的表达水平进行多重可视化分析。当探针完成目标生物分子定位后，通过离线原位裂解或在线实时裂解，将探针上修饰的报告离子释放、解吸并引入质谱仪进行信号读取，从而高灵敏、多指标地完成靶点及其通路分子的空间分布表征。本方法的建立为精准探究候选药物作用的分子靶向性，深入评价候选药物的药效或潜在毒性的分子机制，发现上市药物全新临床适应症等药物研发关键问题具有重要的应用价值。

药物靶点在疾病发生发展进程中起关键调控作用，与药效或毒副作用有直接关联。阐明药物干预下靶点信号通路分子及其调控下游代谢的时空动态变化，对药效与毒性评价、分子机制阐述至关重要。解吸电喷雾电离质谱成像 (DESI-MSI) 已广泛应用于体内药物分析、空间代谢组学等，其可检测分子涵盖药物、代谢物、脂质等分子量低于1000的小分子有机物，然而由于功能生物大分子的超高分子量、低丰度和低电离效率，直接对药物靶点成像仍然是DESI-MSI的巨大挑战。本研究设计合成了一系列苯硼酸类标签分子，将其与抗体非识别区人工修饰侧链上的半乳糖胺通过苯硼酸酯键共价结合，利用酸性电喷雾溶剂可在微秒时间内快速将苯硼酸酯键断裂的特性，实现了标签分子的在线原位释放，使得DESI-MSI 在单张组织切片上定位多个不同的功能生物大分子成为可能，实现了基于DESI质谱成像的多重免疫组化检测，该方法命名为“immuno-DESI-MSI”。苯硼酸类标签分子硼元素的引入，不仅实现了pH调控的可逆结合/释放，还使标签分子离子在质谱中具有可辨识的独特同位素分布模式。标签分子含有叔胺及季胺基团，因此具有极高的解吸电离效率，此外，标签分子中具有高度共轭的刚性平面结构和荧光发射特性，使得合成的标签分子-抗体探针，具有组织微区域可分辨的质谱成像和细胞分辨的荧光显微成像双重功能。通过常规DESI-MSI与immuno-DESI-MSI图像配准，即可关联药物、靶点、信号通路、酶以及下游代谢通路多个层次的空间关联信息。本研究选取拉帕替尼为受试药物，探究了其对于药物靶点EGFR及其信号通路相关分子的抑制作用以及下游代谢层面的影响，确证了拉帕替尼通过抑制EGFR信号通路内p-Raf、p-MEK、p-ERK等通路因子，以及两个关键酶PLC、PKC的表达，进而对肿瘤内能量代谢（三羧酸循环、糖酵解、β-氧化）、氮与一碳单元利用、氧化还原稳态、第二信使信号转导等多个层面的代谢产生干预。immuno-DESI-MSI的建立，为临床前药物评价（ADMET、PD/PK）、临床分子病理诊断、空间多组学等生物医药研究领域提供了一种切实可行的分子成像方法支持。