糖基化终末产物通过TET蛋白调控糖尿病皮肤MMP-9去甲基化的作用及机制研究

Our previous study has demonstrated that advanced glycation end products（AGEs） play an important role in the impairment of diabetic wound healing by upregulating MMP-9 expression in keratinocytes via the ERK and p38 pathways.Further BSP and Ms-HRM results showed that AGEs promoted MMP-9 expression through regulating its gene demethylation. However, the exact mechanism remains unknown. It has been reported that TET family proteins are critical enzymes involved in the process of demethylation. We also found that TET gene expression was increased after the treatment of AGEs, accompany with the changes of MMP-9 stimulated by AGEs.Therefore, we speculate that AGEs promote TET activation via the ERK and p38 pathways, and the activated TET proteins regulate the demethylation of MMP-9 gene. In the present study,we aim to investigate the regulation of TET family proteins on MMP-9 gene demethylation stimulated by AGEs,and prove the process is mediated by ERK and p38 pathway.This research may help to discover the new mechanism of the high MMP-9 expression in diabetic skin, and represent potential targets for drug interventions to improve diabetic wound healing.

我们已经证明糖基化终末产物(AGEs)通过ERK和p38上调MMP-9表达，参与糖尿病皮肤病变发生。进一步的BSP测序法和甲基化熔解曲线分析法证实AGEs通过调控去甲基化诱导MMP-9高表达。但是，AGEs活化ERK和p38后如何介导这一去甲基化过程，目前仍不清楚。TET蛋白家族是去甲基化的重要蛋白，我们发现AGEs诱导MMP-9去甲基化的同时，也触发了TET基因的表达上调。因此，我们提出了AGEs调控MMP-9去甲基化的新机制：即AGEs通过ERK和p38上调TET表达，进而由TET介导了MMP-9基因的去甲基化。本项目拟进一步采用CHIP、甲基化DNA测序以及启动子活性分析等方法，旨在获得ERK和p38介导AGEs对TET蛋白的活化、进而影响MMP-9基因去甲基化的可靠证据。本项目有望揭示糖尿病皮肤病变MMP-9高表达的调控机制，为糖尿病皮肤病变治疗确立新的靶点提供更充分的科学依据。

我们前期研究已经证明糖基化终末产物(AGEs)通过调控MMP-9去甲基化，诱导MMP-9高表达，参与糖尿病皮肤病变发生。但是，AGEs如何介导这一去甲基化过程，目前仍不清楚。已知Ten-eleven-translocation (TETs）蛋白家族是去甲基化的重要蛋白，我们发现AGEs诱导MMP-9去甲基化的同时，也触发了TET基因的表达上调。因此，我们提出了AGEs调控MMP-9去甲基化的新机制：即AGEs通过上调TET表达，介导了MMP-9基因的去甲基化。基于此，本研究以人皮肤原代角质形成细胞作为实验模型，探讨糖尿病状态下MMP-9基因启动子区DNA甲基化程度的改变和TETs蛋白家族的表达情况，同时探讨TETs蛋白家族在MMP-9基因启动子区DNA甲基化程度改变中的作用及可能机制。. 首先，我们探讨了AGEs对人皮肤角质形成细胞中MMP-9基因启动子区特异位点甲基化程度和TETs蛋白表达的影响，研究结果表明，AGEs可使体外培养的皮肤角质形成细胞MMP-9基因启动子区DNA特异位点甲基化程度发生改变；皮肤组织表皮层中可表达TET1-3蛋白，糖尿病患者皮肤表皮层TET2表达增加；AGEs可上调体外培养的皮肤角质形成细胞TET2基因表达增高，增加TETs活性。进而，我们观察过表达及抑制TET2基因对人皮肤原代角质形成细胞MMP-9基因启动子区特异CpG位点甲基化程度及MMP-9基因表达的影响，发现TET2可通过调节人皮肤原代角质形成细胞MMP-9基因启动子区部分特异CpG位点甲基化程度，进而调控MMP-9基因的表达；进一步的CHIP实验证实TET2蛋白TET2蛋白直接结合MMP-9基因启动子转录起始点附近片段，参与MMP-9基因的表达调控，并影响皮肤原代角质形成细胞的迁移和增殖能力。. 综上所述，通过本研究的结果，我们在人原代角质形成细胞模型中，证实AGEs可上调TET2基因表达，增强TETs活性；TET2蛋白通过与MMP-9基因启动子区DNA片段直接结合，影响MMP-9基因启动子DNA特异位点甲基化程度进而调控MMP-9基因的表达，影响角质形成细胞的生物学行为。. 本研究发现TET蛋白通过影响MMP-9基因启动子区DNA特异CpG位点的去甲基化改变，从而参与调控MMP-9基因表达的新机制，为阐明糖尿病皮肤病