Sonic Hedgehog 信号通路在癫痫突触机制中的调控作用

Axon guidance factors play an important role in epileptogenesis by regulating the cytoskeleton reorganization and synaptic remodeling. Using the gene chips and protein chips, we analyzed differential gene expression in the anterior temporal neocortex of intractable epilepsy patients relative to control patients,and the results showed that a variety of differentially expressed genes and proteins were related to the axon guidance family. Further analysis suggested that most of these guidance cues belonged to the Sonic hedgehog (Shh) / Src signaling pathway.The patients with drug-resistant epilepsy, epilepsy animal models and cell models will be used for our research. The Shh shRNA lentiviral vectors and adeno-associated virus as well as Scr shRNA lentiviral vectors will be constructed for our study in vivo, and the chemical agonists and antagonists in Shh signaling pathway will be used for the study in vitro. Timm staining , stereology, whole cell patch clamp and other research techniques will be taken to explore the possible mechanism of the Sonic hedgehog (Shh) / Src signaling pathway involved in synaptic regulation. We aim to reveal whether activation or inhibition of Shh / Src signaling pathway could affect synaptic network reorganization in epileptogenesis ,to clarify the etiological factors in epilepsy, and to provide new target for the discovery of antiepileptic drug.

轴突导向因子可通过调节细胞骨架重组、突触重塑在癫痫形成中起重要作用。课题组前期在对难治性癫痫患者术后脑组织进行的基因芯片和蛋白芯片分析发现，在差异表达的基因和蛋白中有多种因子与轴突导向相关，后续研究发现具有重要轴突导向作用的 Sonic hedgehog (Shh) /Src信号通路参与癫痫形成。本项目拟在前期研究基础上，以耐药性癫痫患者、癫痫动物模型和细胞模型为研究对象，构建Shh shRNA慢病毒载体和过表达腺相关病毒载体以及Scr shRNA慢病毒载体进行在体干预，并使用Shh信号通路的化学激动剂和抑制剂进行离体干预，用Timm染色、体视学、全细胞膜片钳等多种研究技术从表达、功能、机制三个层面深入探索Shh /Src信号通路在癫痫形成中的突触调节机制。明确激活或抑制Shh /Src信号通路是否能通过调节突触网络重组影响癫痫电活动，以揭示癫痫的成因，为癫痫的防治寻找新的药物作用靶点。

本项目以耐药性癫痫患者、癫痫动物模型和细胞模型为研究对象，构建 Sonic hedgehog(Shh) 信号通路 shRNA慢病毒载体和过表达腺相关病毒载体进行在体干预，并使用Shh信号通路的化学激动剂和抑制剂进行离体干预，用Timm染色、体视学、全细胞膜片钳等多种研究技术从表达、功能、机制三个层面深入探索Shh信号通路在癫痫形成中的突触调节机制。并研究与Shh信号通路密切相关的突触粘附分子neuroligins是否能通过调节突触网络重组影响癫痫电活动，以揭示癫痫的成因，为癫痫的防治寻找新的药物作用靶点。研究结果: 分子生物学实验提示Shh信号通路以及neuroligins在癫痫患者脑组织中有异常表达。Shh信号通路的抑制剂环耙以及构建Shh的shRNA慢病毒knockdown 后均能明显延长癫痫模型大鼠发作潜伏期、降低癫痫发作频率、缩短癫痫发作持续时间、降低癫痫的发作级别；构建Shh的过表达慢病毒对大鼠脑组织海马神经元进行干预后，能明显缩短癫痫模型大鼠发作潜伏期、增加癫痫发作频率、延长癫痫发作持续时间、增加癫痫的发作级别。Shh信号通路的关键蛋白Smoothened与突触粘附分子NL1在神经元中共表达，并主要分布在兴奋性神经元轴突。提示Smoothened与突触粘附分子NL1在功能上可能有密切联系。进一步研究结果发现， NL1在癫痫大鼠海马中的knockdown能减轻癫痫发作程度并延长癫痫发作潜伏期。NL1 shRNA慢病毒能抑制慢性期大鼠海马脑片CA1区锥体细胞的过度兴奋。抑制内源性NL1的表达能降低NMDAR1的表达，通过减少细胞膜上NMDAR1的数目抑制NMDAR活性，从而通过减弱谷氨酸对NMDAR1的作用，选择性降低海马脑片NMDAR依赖性突触电流。科学意义：本项目首次证实Shh信号传导通路以及与其关系密切的突触粘附分子neuroligins在癫痫形成中的作用，为抗癫痫形成的研究开辟一条新途径，为抗癫痫药物的开发提供可能的新靶点。