一菌双酶耦联降解土壤中多环芳烃及酶的定向进化和降解机理

多环芳烃(PAHs)是环境中普遍存在的有机污染物，双加氧酶和脱氢酶是PAHs生物降解过程中最关键的酶。本项目拟以双加氧酶和脱氢酶为研究对象，利用酶分子定向进化技术，在基因水平上对降解多环芳烃的双加氧酶和脱氢酶进行分子定向进化改造，提高酶活力和环境耐受力，并将双加氧酶和脱氢酶基因在同一大肠杆菌中耦联表达，实现双酶在基因水平和降解活性上的耦联和匹配，提高酶环境耐受能力和降解四环以上PAHs的效能，分析酶降解PAHs的中间产物，研究降解机理，提出强化PAHs污染土壤生物修复的技术措施，为土壤环境中PAHs污染的修复提供依据。

多环芳烃(PAHs)是环境中普遍存在的有机污染物，双加氧酶和脱氢酶是PAHs生物降解过程中最关键的酶。项目在课题组已有的工作基础上，对双加氧酶和脱氢酶基因进行了序列分析和表达，利用定点突变和易错PCR技术分别对重组双加氧酶和脱氢酶进行了改造，最终获得活力提高的脱氢酶突变体和双加氧酶突变体各1株，并对改造前后酶进行了对比分析，为其它有毒有机污染物降解酶研究奠定了基础；利用Nickel-NTA亲和纯化柱纯化，获得了纯度较高的野生型和改造后双加氧酶和脱氢酶，开展了相关酶学性质的研究，改造后双加氧酶和脱氢酶稳定性和降解性得到了明显提高；将双加氧酶和脱氢酶基因在同一大肠杆菌中表达，通过增加双加氧酶基因拷贝数来进行基因表达调控，同时成功构建了一菌双酶体系；通过一菌双酶体系降解特性研究表明：降解能力表现为35℃>25℃>15℃，pH7.0＞pH8.0＞pH9.0＞pH10.0＞pH5.0，该体系环境耐受能力和降解芘和苯并[a]芘的能力均有很大提高，最佳降解条件为35℃、pH 7.0。在土壤中降解表现出在潮土中的降解效果明显好于红土，加入调控后一菌双酶体系产生酶液（2次）明显加快了芘和苯并[a]芘的消失。根据拓扑结构分析、同源建模，对改造后双加氧酶和脱氢酶功能残基，活性残基，活性口袋，底物通道等进行分析，推断出与酶活、选择性等酶学性质有关功能区域；并对一菌双酶体系对芘和苯并[a] 芘降解产物进行GC-MSS进行分析，推断其降解机理。