CO/HO-1及NO信号系统介导5-氨基乙酰丙酸(ALA)提高拟南芥盐适应性机理研究

5-Aminolevulinic acid (ALA) as a kind of important plant endogenous substance, has an significant role in plant resistance to salinity stress. However, the specific mechanism of ALA to salinity is not clear at present, and there is no formation of related salinity resistance signaling pathway to ALA now. ALA is a key precursor in the biosynthesis of all porphyrins compounds, such as Chlorophyll, heme, and phytochrome. Heme as a substrate to decompose and generate carbon monoxide (CO) under the action of HO-1, which has an important signaling role in salinity stress resistance. Studies show that the CO and nitric oxide (NO) signaling molecules have similar physiological functions, and has a significant role in the resistance to salinity stress. The project based on previous studies of ALA, CO and NO to salinity stress resistance, use the seeds and seedlings of Arabidopsis thaliana as experimental materials, correlate the ALA metabolism and signal transduction under salinity stress by the heme metabolism, CO/HO, and NO. Taken the methods of inhibition or induction of key enzymes in ALA metabolic processes to block or induce the signaling channel. Take advantage of the pharmacology and molecular biology methods, at the levels of the physiological, biochemical and molecular biological, make clear the ALA signal transduction pathways and the mediation role of CO/HO and NO, thereby revealing the mechanism of ALA to improve the salinity stress adaptability of Arabidopsis thaliana. The study will provide theoretical basis and technical support for crop cultivation.

ALA作为一种重要的植物内源物质，在植物抗盐胁迫方面具有重要作用，但目前对ALA的具体抗盐机理尚不明确，没有形成相关的ALA抗盐胁迫信号通路。ALA在植物体内直接参与卟啉类化合物的生物合成，进而生成血红素，血红素作为底物在HO-1的作用下发生分解并生成具有重要信号传导作用的CO。研究表明CO与NO信号分子具有相似的生理功能，并且在的抗盐胁迫中具有显著地作用。本项目基于对ALA、CO及NO抗盐作用所做的前期研究，以拟南芥种子及幼苗为材料，将ALA在盐胁迫下的代谢及信号转导通过血红素的代谢与CO/HO及NO相关联。采取对ALA代谢过程中不同的关键酶进行抑制或诱导的方法，阻断或诱导通路，同时利用药理学及分子生物学手段，在生理生化及分子生物学水平上，明确ALA信号转导途径及CO/HO和NO在信号通路中的介导作用，从而揭示ALA提高拟南芥盐适应性的机理，此研究将为药用植物抗逆提供理论依据和技术支撑。

ALA作为一种重要的植物内源物质，在植物抗盐胁迫方面具有重要作用，但目前对ALA的具体抗盐机理尚不明确，没有形成相关的ALA抗盐胁迫信号通路。ALA在植物体内直接参与卟啉类化合物的生物合成，进而生成血红素，血红素作为底物在HO-1的作用下发生分解并生成具有重要信号传导作用的CO。本项目基于对ALA、CO及NO抗盐作用所做的前期研究，以拟南芥种子及幼苗为材料，首次将ALA在盐胁迫下的代谢及信号转导通过血红素的代谢与CO/HO及NO相关联。采取对ALA代谢过程中不同的关键酶进行抑制或诱导的方法，阻断或诱导通路，同时利用药理学及分子生物学手段，在生理生化及分子生物学水平上，明确了ALA信号转导途径及CO/HO和NO在信号通路中的介导作用，从而揭示ALA提高拟南芥盐适应性的机理。实验中用HO-1的诱导剂Hematin或CO饱和水溶液(50%)分别处理种子和幼苗（同时设定相应的空白对照、ALA对照及盐对照），测定HO-1活性，通过Western Blot测定其蛋白表达水平，通过实时荧光定量PCR(qRT-PCR)技术测定HO1(HY1) 的基因表达程度。分别用Oxadiargyl和N-Methylprotoporphyrin两种酶抑制剂，对血红素前体原卟啉Ⅸ(Proto Ⅸ)合成的关键酶原卟啉原氧化酶(PPO)以及血红素(Heme)合成的关键酶亚铁鳌合酶(FeCh)进行抑制（同时设定相应的空白对照、ALA对照及单盐对照），阻断Heme的合成路线，测定血红素含量的变化，然后测定血红素加氧酶(HO-1)酶活。结果表明酶的含量和表达程度均有不同程度变化，确定了ALA通过CO/HO-1信号系统调节了拟南芥幼苗的生长，证明了此通路的存在。用一氧化氮合酶(NOS)或硝酸还原酶(NR)的抑制剂Na2WO4及L-NAME抑制体内NO的合成，观察了外源CO的抗盐效果。用CO水溶液对种子及幼苗进行处理，用NO专一清除剂cPTIO对体内NO进行清除，测定了NR及NOS酶的活性变化，并通过Western Blot测定其蛋白表达，根据其它指标的测定分析抗盐效果。实验证实CO/HO-1信号系统与NO存在关联，通过实验得出了三条基本的通路。根据实验结果，综合CO/HO-1及NO在介导ALA提高拟南芥种子及幼苗抗逆性的信号通路上的作用，初步提出了ALA在提高拟南芥抗盐能力方面的机理，基本上完成了最初的实验设