纳豆菌糖肽对巨噬细胞的双向免疫调节及NF-kB信号通路的调控研究

纳豆芽孢杆菌发酵食品在我国具有悠久的历史，主要用于发酵豆类制作调味品。本项目采用课题组筛选的纳豆芽孢杆菌益生菌株进行控制发酵，提取分离得到纳豆菌糖肽，并研究其对巨噬细胞的双向免疫调节作用及其分子机理。以小鼠巨噬细胞和大肠杆菌 LPS 诱导产生的巨噬细胞炎症模型为实验模型，显微观察纳豆菌糖肽对小鼠巨噬细胞形态的影响,酶标仪检测巨噬细胞对中性红吞噬能力；采用 Griess、ELISA、Western blotting 等方法检测免疫因子 NO、IL-1β、PGE2、COX-2 和 iNOS 的变化和表达；采用免疫荧光法观察 NF-κB 核转位，Western blotting 法检测 NF-κB 和 iκB 的表达，流式细胞术检测 LPS-FITC 与细胞结合后的荧光强度变化。本项目研究对于我国传统发酵豆制品的益生功能开发具有深远的影响和重要的学术价值。

纳豆是传统发酵豆制品，由纳豆芽孢杆菌发酵蒸煮大豆制备而来。纳豆具有多种保健功能，如溶血栓、抗肿瘤、抗高血压，调节雌性激素，预防骨质疏松等。目前已发现纳豆中的活性成分主要由纳豆激酶、维生素K2、大豆异黄酮、γ-高聚谷氨酸等。尽管国内外已经对纳豆做了大量研究，然而对于纳豆中存在的一些糖复合物的研究信息较少。纳豆菌糖肽的免疫活性和作用机理的研究还未见报道。本研究以脱脂纳豆冻干粉为原料，提取纳豆糖肽（BNGP），从粗品BNGP中分离纯化得到高纯度BNGP组分，并对它们的结构、体内外免疫活性及作用机理进行研究。主要研究内容及结果如下：.1、采用响应面分析法（RSM）优化超声辅助提取BNGP工艺。在最优工艺条件下，BNGP最高提取得率为1.89%；经DEAE-52纤维素阴离子交换柱层析和SephadexG-100凝胶柱层析纯化，以及高效凝胶渗透色谱（HPGPC）分析，从纳豆多糖中得到两种纯度较高BNGP： BNGP-1-b和BNGP-2-a，对其结构进行了初步鉴定。 .2、经环磷酰胺（CTX）腹腔注射建立小鼠免疫功能低下模型。给药30d后，通过对小鼠脾脏、胸腺指数，血清溶血素水平，脾细胞转化能力，细胞因子分泌以及体外脾细胞增殖作用的测定，研究BNP对免疫功能低下小鼠免疫调节作用的影响。结果显示BNGP 具有增强免疫功能低下小鼠体液和细胞免疫的作用。.3、从小鼠腹腔中分离、培养小鼠腹腔巨噬细胞和培养RAW264.7巨噬细胞，研究了纳豆菌糖肽（BNGP）对正常状态及脂多糖（LPS）激活状态巨噬细胞的免疫调节作用。采用不同浓度的BNGP单独处理或LPS和不同浓度的BNGP共同处理巨噬细胞，检测各项指标，研究结果显示BNGP对巨噬细胞具有双向免疫调节作用。.4、研究了纳豆菌糖肽（BNGP）免疫调节作用相关机制。采用流式细胞术分析BNGP对LPS-FITC与RAW264.7巨噬细胞表面受体结合的干扰作用，免疫荧光分析BNGP对NF-κB p65核转位的影响，Western blot检测BNGP对NF-κB p65在细胞质及细胞核的表达，对NF-κB的抑制性蛋白IκB-α磷酸化的影响。