基于核酸适配体的环境响应分子识别分离介质制备及酶纯化机理研究

本课题着眼于核酸适配体(Aptamer)这一类新型生物识别分子，利用这类识别分子良好的稳定性和专一性识别靶物质的优点，通过与温度以及光响应高分子复合，构筑新型具有环境响应性质的核酸适配体分子识别分离介质。以溶菌酶为模型蛋白，开展微环境下结构界面对酶的吸附和解吸机理研究。通过环境因素对响应高分子的构象调节，增大Aptamer与酶结合的位阻，实现酶的解吸，以期通过介质的温度或光响应特性解决Aptamer分子识别分离蛋白难以洗脱的问题。通过核酸适配体与响应高分子的不同组合方式、微环境下结构界面的变化对酶的吸附和解吸机制的研究，以及工艺过程的优化建立酶生物产品高选择性纯化新方法。

1. 偶氮苯修饰核酸适配体结合蛋白的光响应性质研究.将偶氮苯亚磷酰胺单体修饰到凝血酶核酸适配体(ATP29)序列的不同位置，制备偶氮苯修饰适配体Azo-APT1，Azo-APT2，Azo-APT3，Azo-APT4，Azo-APT5。研究表明，Azo-APT1、2、4、5序列与凝血酶结合力明显变弱，由于偶氮苯破坏ATP29序列自身的一级结构，导致其不能形成G-四分体结构与凝血酶结合。而Azo-APT3与凝血酶的结合表现出明显光响应性，可见光照(>450nm)下比紫外光照(365nm)下与凝血酶结合降低45%以上。由于Azo-APT3中偶氮苯处于G12和G13序列之间，在可见光照射时偶氮苯苯环结构呈伸展的状态，与T19位核苷酸竞争结合凝血酶，使序列中其他核苷酸无法与凝血酶接触，抑制二者结合。在紫外线照射时偶氮苯呈顺式结构，苯环发生对折，不与凝血酶作用，适配体T19能够与凝血酶245位的苯丙氨酸接触，诱导适配体G-四分体结构形成而与凝血酶结合。.2. 基于偶氮苯修饰核酸适配体的光响应性分离介质制备及蛋白可控分离研究.将ATP29适配体偶联偶氮苯亚磷酰胺单体修饰的ATP29互补序列通过Au-S键修饰于金纳米颗粒表面，实现了仅通过重复改变紫外光照(365nm)以及可见光照(>450nm)来可逆控制分离介质对凝血酶的捕获与释放，并成功实现了重复从血浆中分离凝血酶，为生物产品绿色化生产奠定研究基础。.3. pH/温度双响应嵌段共聚物相行为的谱学研究.用红外光谱和核磁技术研究了PAA-b-PEO-b-PPO-b-PEO-b-PAA温度和pH响应的相变过程。升高温度及提高pH值可破坏聚合物分子内COOH之间及COOH与C-O-C间氢键，促使聚合物分子链段发生构象转变，使聚合物水溶液发生相转变。COOH与C-O-C间氢键对聚合物水溶液相变过程起决定性作用。低温及低pH值时，COOH与C-O-C间形成强氢键，嵌段共聚物链段相互缠绕附着析出，导致相分离。温度升高，COOH与C-O-C间强氢键发生断裂，缠绕链段相互分离，PAA上的亚甲基与水结合使PAA链段变得更亲水，嵌段共聚物形成小簇聚集体，发生微相分离。pH值增大使羧基与醚氧基间氢键断裂临界温度Tc及PAA-b-P65-b-PAA发生聚集的临界聚集温度CAT降低，降低聚合物浓度也使Tc降低。