菊花响应盐胁迫的miRNAs及其靶标的鉴定与功能分析

Chrysanthemum, one of the famous traditional flowers, is widely cultivated in China. Chrysanthemum grandiflora is one of the chrysanthemum cultivar groups suitable for the field cultivation. The flowers of Chrysanthemum are usually bright in color, spend much dense and plants with dwarf stands. It is widely used in the garden. In order to improve the possibility of its application in saline-alkali land, we based on our previous the salt stress transcriptome data of Chrysanthemum×grandiflora ‘Niu 9717’, and carries out the research on the regulation mechanism of miRNAs and its target genes under salt stress. We will use physiology, bioinformatics and genetics ways, focusing on studies as follows: (1) We will observe the morphological characteristics and physiological changes, and analyze physiological traits of chrysanthemum under salt stress. (2) We will sequence the miRNAs and identify candidate miRNAs which related to salt stress. (3) We will sequence the degradome , combining with the analysis of degradome to identify miRNAs target genes which related to salt stress. (4) We will further separate and identify the functions of candidate genes to reveal key genes associated with salt stress. The expected outputs will unravel the physiological and molecular responses of chrysanthemum to salt stress at the morphology, physiological, molecular and genetic levels, and will provide valuable reference for the salt tolerance-related molecular mechanism in chrysanthemum and provides genetic resources for the cultivation of chrysanthemum salt tolerant varieties.

菊花是我国的传统名花，露地菊是适于露地栽培的菊花品种群之一，具有花色丰富、花多而密、植株低矮等特点，在园林中广泛应用。为提高其在盐碱地应用的可能性，本项目以露地菊‘纽9717’盐胁迫诱导转录组数据为参考，开展露地菊盐胁迫下miRNAs及其靶基因的调控机理研究。采用生理学、生物信息学、遗传学等方法，着重开展四方面研究：（1）盐胁迫下菊花的形态观察和生理变化研究，探明菊花对盐胁迫的生理响应特性；（2）盐胁迫下菊花miRNAs测序分析，筛选与盐胁迫相关的候选miRNA；（3）盐胁迫下菊花降解组测序分析，鉴定与盐胁迫相关的miRNA的靶基因；（4）关键miRNAs及其靶基因的分离和功能验证，探明这些miRNAs及其靶基因的功能与作用。本项目从形态学、生理学、分子生物学和遗传学4个层面揭示菊花对盐胁迫的生理与分子响应，为阐释菊花抗盐分子机理提供依据，并为菊花抗盐性品种培育提供基因资源。

菊花是我国传统名花，在园林中广泛应用，为促进其在盐碱地的使用，研究菊花耐盐机制，对获得抗性基因资源并培育新品种具有重要意义。项目使用200 mM NaCl溶液处理露地菊幼苗，研究其表型和生理变化，取处理12h后的根和叶进行转录组测序，获得39185个Unigene，根和叶中分别鉴定出3094和7880个差异表达基因。根对盐胁迫的反应集中在编码离子转运蛋白基因的上调，基因NHX和HKT的表达发生了变化，从而改变渗透调节能力，维持较高的生物膜稳定性。而在叶中，反应集中在苯丙烷生物合成和植物激素信号转导途径，在盐响应过程中发挥重要作用。对200 mM NaCl处理下的露地菊进行Small RNA高通量测序，鉴定出280个miRNAs，其中已知的miRNAs 201个，新的miRNAs 79个，利用降解组预测了显著差异的miRNAs的靶基因，大量miRNAs及其靶基因参与植物激素的产生与代谢过程、蛋白质的结合和信号转导通路等。成功从露地菊中克隆得到长度为221 bp的miR398a前体序列，利用农杆菌介导的转化技术，获得过表达拟南芥株系。对盐、干旱处理后的野生型（WT）和过表达miR398a的拟南芥进行表型观察和生理指标测定，结果显示过表达cgr-miR398a减弱了拟南芥抵抗非生物胁迫能力，在拟南芥响应非生物胁迫中起着负调控作用。从野菊中克隆了cin-miR396a前体序列及其启动子，并研究cin-miR396a前体序列对野菊的遗传转化及对其耐盐、耐旱性影响。结果表明cin-miR396a长度为145 bp，含有完整的茎环结构，启动子区具有光信号、茉莉酸甲酯、赤霉素、水杨酸、脱落酸等多种响应元件，推测cin-miR396a参与多种逆境胁迫下的应答及调控。利用叶盘法获得过表达cin-miR396a的转基因野菊。cin-miR396a在野菊中的过量表达会降低野菊的耐盐性、耐旱性。利用烟草叶片瞬时转化验证了cin-miR396a的两个靶基因，即CiGRF1、CiGRF5，它们的表达受盐、干旱处理诱导且在转基因野菊中受到抑制。结果揭示野菊miR396a-GRFs调控模块在野菊发育和野菊响应非生物胁迫中的独特作用，cin-miR396a在野菊响应盐、干旱胁迫时起负调控作用。项目通过研究菊花对盐胁迫的生理与分子响应，为阐释菊花抗盐分子机理提供依据，并为菊花抗盐性品种培育提供基因资源。