补脾益肾颗粒通过调整肠道微生态影响芳烃受体AHR通路治疗慢性肾脏病的机制研究

Our previous multi-center RCT results show that the Bupi Yishen formula is effective and safe in treatment of chronic kidney disease. Modern "intestinal axis" theory point out that chronic kidney disease intestinal flora disorder, impaired intestinal barrier function, pathogenic bacteria produce uremic toxins, activation of renal and circulating AHR signaling pathway, playe an important role in the progression of chronic kidney disease. The current study shows that chronic renal failure intestinal flora disorders and metabolic disorders is related to the spleen and kidney insufficient of traditional Chinese medicine, intestinal flora and metabolic regulation may be the key mechanism of Bupi Yishen formula in delaying the progress of chronic kidney disease. Our preliminary use of PCR technology found that BYF can regulate intestinal flora in CKD rats, down-regulated urinary toxin indoxyl sulfate levels, and can regulate serum and kidney AHR levels. This project will be used 16S rRNA second-generation sequencing and other technologies in animal models to study whether the BYF can regulate intestinal flora enrichment and function, improve intestinal barrier function, regulating uremic-AHR signal Access axis slows the progression of chronic kidney disease. Based on this, the mechanism of action of BYF was verified through the intervention of animal model gut flora and the intervention of cell model AHR.

我们前期多中心RCT研究结果表明补脾益肾颗粒防治慢性肾脏病进展临床疗效确切、安全有效。现代“肠肾轴”理论指出慢性肾脏病肠道菌群紊乱、肠道屏障功能受损，致病菌产生尿毒症毒素，激活肾脏及循环芳烃受体AHR信号通路，在慢性肾脏病进展中发挥着重大作用。目前研究表明慢性肾衰肠道菌群紊乱及其代谢异常，与中医脾肾关系密切，肠道菌群及代谢调控，可能是补脾益肾颗粒延缓慢性肾脏病进展的关键机制。我们前期运用PCR技术初步发现补脾益肾颗粒能够调整CKD大鼠肠道菌群变化，下调尿毒素硫酸吲哚酚水平，并能调控肾脏AHR水平，抑制肾小管间质纤维化。本项目将进一步采用16S rRNA二代测序等技术，在动物模型上研究补脾益肾颗粒是否能够通过调节肠肾轴相关菌群的丰度和功能，改善肠道屏障功能，调控尿毒素-AHR信号通路轴，延缓慢性肾脏病进展。在此基础上通过对动物模型肠道菌群的干预及细胞模型AHR的调控，验证补脾益肾颗的作用机制。

我们前期多中心RCT研究结果表明补脾益肾颗粒方治疗慢性肾脏病（CKD）进展临床疗效确切、安全有效。目前研究表明CKD肠道菌群紊乱及其代谢异常，与中医脾肾关系密切，肠道菌群及代谢调控，可能是补脾益肾颗粒延缓CKD进展的关键机制。本课题采用5/6肾切除CKD大鼠模型观察到补脾益肾颗粒方显著降低了CKD大鼠血肌酐、尿蛋白、肾小管间质纤维化水平，具有肾脏保护作用。通过16SrRNA测序及生物信息学分析，观察到补脾益肾颗粒方能够改善CKD大鼠的肠道菌群多样性，提高了Prevotella，Phascolarctobacterium和Megamonas的相对丰度。补脾益肾颗粒方还能够改善结肠病理损伤，提高紧密链接蛋白表达，改善肠道屏障功能，并可增加肠道短链脂肪酸的生成。补脾益肾颗粒方还能减少血清色氨酸相关毒素硫酸吲哚酚、犬尿氨酸水平，抑制肾脏AhR信号通路蛋白AhR、CyP1A1、CyP1B1的表达。进一步对CKD大鼠行粪菌移植验证补脾益肾方调控肠道菌群治疗CKD的作用。结果表明移植补脾益肾颗粒方粪菌能够在一定程度上降低CKD大鼠血肌酐、尿素氮、肾小管间质纤维化、血清硫酸吲哚酚水平，但差异不显著。移植补脾益肾颗粒方粪菌能够改善CKD大鼠肠道粘膜屏障功能，提高肠道occludin、cladudin水平，抑制肾脏AhR 信号通路蛋白AhR、CyP1A1、CyP1B1的表达。最后在细胞实验上研究发现补脾益肾方含药血清能够抑制硫酸吲哚酚（IS）诱导肾小管上皮细胞损伤，能够抑制小管上皮细胞AhR信号通路激活，并通过AhR上调（质粒）、下调（siRNA）体系验证了补脾益肾方含药血清对AhR的作用。同时发现君药黄芪的关键活性成分黄芪甲苷能够抑制IS介导肾小管上皮细胞损伤及凋亡。黄芪甲苷能够抑制小管细胞ROS水平，改善线粒体膜电位，能够抑制AhR的表达及下游蛋白的表达。分子对接实验表明：黄芪甲苷和蛋白 AhR表面结合的较为紧密，具有较好的匹配性，黄芪甲苷结合到 AhR蛋白活性位点，与活性位点附近的TYP 239、LEU 253、ASN244、GLU 243和HIS 153五个氨基酸形成氢键相互作用。考虑黄芪甲苷能够直接作用于AhR，从而减轻IS介导小管细胞损伤。本研究从肠道菌群和肾脏AhR靶蛋白两方面全面阐述了补脾益肾颗粒方治疗慢性肾脏病的作用机制，为理解CKD从脾肾论治提供新的视角。