内皮细胞PFKFB3调控的糖酵解通路与己糖胺合成通路的交互作用对血管稳态的影响及其在动脉粥样硬化中的作用研究

As the major regulator of vascular homeostasis, the endothelium exerts a number of vasoprotective effects, including vasodilation and inhibition of inflammatory responses. Endothelial activation dysfunction causes the disruption of vascular homeostasis and drives the pathogenesis of atherosclerosis. Endothelial cells (ECs) rely on aerobic glycolysis for adenosine triphosphate production and fueling.angiogenesis; however, it remains unknown whether the aerobic glycolysis affects endothelial activation and dysfunction as well as the atherogenesis. Our preliminary data for this project showed that atherogenic inflammatory stimuli upregulate the expression level of PFKFB3, one key glycolytic enzyme, and drive the glycolytic reprogramming in ECs. Knockdown of PFKFB3 induces EC activation, decreases the production of Nitric oxide (NO) and increases the hexosamine biosynthetic pathway (HBP) flux. Based on these findings, we will pursue the.following Specific Aims. Firstly, we will define the exact role of PFKFB3-driven glycolysis in vascular inflammation and vessel dilation using EC-specific PFKFB3 knockout mice. Secondly, we will dissect whether the crosstalk between glycolysis and HBP affects the vascular inflammation and vessel dilation. Finally, we will uncover whether the hyperglycemia inhibits PFKFB3-driven glycolysis in ECs and impairs endothelial homeostasis.

内皮活化与功能障碍是诱导血管失稳态，进而促使心血管疾病如动脉粥样硬化（AS）发生发展的早期关键病理机制。作为内皮细胞的主要供能途径，糖酵解在调控内皮细胞增殖、迁移以及血管新生等过程中发挥了关键作用，但其调控内皮功能及其机制以及对AS发生的影响尚不清楚。我们的预实验结果显示：促炎因子和扰动性血流可促进内皮细胞糖酵解途径关键酶6-磷酸果糖-2 激酶亚型3（PFKFB3）的表达，导致细胞发生糖酵解代谢重组。下调PFKFB3表达能加重内皮炎症反应，减少内皮一氧化氮的合成并增加内皮O-连接糖基化水平。本项目拟在上述基础上，采用PFKFB3内皮特异性敲除小鼠，首先探讨糖酵解途径与己糖氨合成通路的交互作用对血管舒张功能和血管炎症反应的影响及其分子机制，随后进一步研究PFKFB3调控的内皮糖酵解对AS发生发展的影响。上述工作将从内皮代谢角度揭示内皮细胞稳态新机制，为防治AS等心血管疾病提供新的思路和靶点。

内皮活化与功能障碍是诱导血管失稳态，进而促使心血管疾病如动脉粥样硬化（AS）发生发展的早期关键病理机制。作为内皮细胞的主要供能途径，糖酵解在调控内皮细胞增殖、迁移以及血管新生等过程中发挥了关键作用，但其调控内皮功能及其机制以及对AS发生的影响尚不清楚。在本项目研究中，我们利用内皮细胞特异性糖酵解途径关键酶6-磷酸果糖-2激酶亚型3（PFKFB3）敲除小鼠和海马生物能量检测以及多种分子生物学技术手段，研究了PFKFB3介导的糖酵解重组对内皮细胞炎症反应和NLRP3炎症小体的调控作用，并进一步研究了PFKFB3介导的糖酵解对动脉粥样硬化早期发生过程的影响。我们发现：1）内皮细胞组成性PFKFB3纯合敲除能诱导内皮炎症，损伤血管舒张功能和AS发生；过度敲低PFKFB3损伤内皮稳态；2）过度敲低PFKFB3能促使葡萄糖更多流入己糖胺合成通路并促进了p65和eNOS糖基化，进而分别促进了p65的转录促炎功能以及抑制了eNOS的活性和NO的产生；3）在AS状态下，内皮细胞诱导性PFKFB3杂合敲除能抑制内皮炎症反应和NLRP3炎症小体的激活，并缓解了AS的发生；体外部分敲低PFKFB3能缓解炎症因子诱导的NLRP3炎症小体组分NLRP3, pro-caspase 1和pro-IL-1β的表达；4）PFKFB3介导的糖酵解能增加细胞内NADH水平，并诱导NADH敏感的转录共抑制因子CtBP1发生二聚化，药理或点突变抑制其二聚化能转录抑制NLRP3, pro-caspase 1和pro-IL-1β的表达以及AS的发生；5）FOXP1能转录抑制NLRP3, pro-caspase 1和pro-IL-1β的表达，生物信息学和免疫共沉淀显示单体CtBP结合FOXP1并增强其转录抑制功能，而NADH依赖的CtBP二聚化解除其与FOXP1的结合，使FOXP1对 NLRP3, pro-caspase 1和pro-IL-1β的转录抑制部分丧失。该研究项目从内皮细胞代谢角度出发探讨糖酵解调控分子PFKFB3与AS发生发展的关系。2014年初以PFKFB3为靶点的首个抑制剂类药物（PFK158）在美国进入抗肿瘤相关的临床试验阶段。本项目不仅揭示了免疫代谢在AS发生发展中的作用，还可能对靶向细胞代谢防治AS提供新途径，具有较强的转化医学研究潜力。