压力负荷诱导趋化因子RANTES在骨关节炎软骨细胞表达的调控分子机制研究

骨关节炎（OA）是一种常见的关节疾患，严重影响人们的生活质量。其病理机制为软骨基质的合成与降解代谢平衡失调，降解>合成所致。我们及其他学者的前期研究显示趋化因子RANTES在调节软骨基质代谢中起关键性作用。为进一步明确软骨细胞调控RANTES表达的分子机制，我们根据人基因库资料分析RANTES启动子上的转录因子应答元件(RE), 构建系列的野生及突变型报告载体，应用荧光酶报告载体、突变载体、凝胶迁移实验及染色质免疫沉淀分析确定所筛选靶RE。利用重组腺病毒及siRNA转染抑制或上调靶分子，探讨所筛选的目的基因对RANTES mRNA及蛋白质表达的影响。运用实时定量RT-PCR、ELISA、免疫组化等方法分析目的基因的高表达或基因沉默对压力诱导的软骨细胞表达RANTES的影响，从而深入探讨软骨细胞RANTES表达的调控分子机制，为OA的基础及临床研究提供新的理论和实验基础。

骨关节炎（OA）是一种常见的慢性关节炎,大量研究OA的发生与趋化因子RANTES有关，本研究拟在寻找调控RANTES的应答元件，并通过突变子载体转染探索相应应答元件在调控软骨细胞表达RANTES中的作用，以期关键调控元件，为在OA开展抑制病变分子的治疗奠定实验室基础。.方法：本研究采用TESS软件，分析RANTES启动子-2K序列的基因应答元件（RE），并构建RANTES启动子的克隆及报告基因载体，利用凝胶迁移实验（EMSA）及染色质免疫沉淀分析（CHIP）报告基因载体进行分析，同时采用靶基因转染表达观察对压力诱导软骨细胞表达RANTES的影响。.结果：（1）利用TESS软件，分析RANTES启动子-2K序列的基因应答元件（RE）结果：我们人基因组数据库资料，利用TESS软件对RANTES启动子-2K序列的基因应答元件（RE）分析（图1），发现RANTES启动子有多个应答元件，包括：AP-1（-961）、IEF-1（-579）、C/EBP（-231）、SP-1(-79)和NFκB(-44，-30)；（2）构建了RANTES启动子的克隆及报告基因载体， EMSA及CHIP）证实hrantes-m5、-m6( NF-kB1，NF-kB2)突变报告载体获阳性结果，表明NF-kB1，NF-kB2介入RANTES的调控。（3）发现RANTES mRNA在早期病变的OA软骨表达最为明显，并随压力的增加而逐渐升高。（4）经多次实验，经转染后大部分细胞死亡，少部分存活细胞不再分裂生长，无法进行功能检测。.结论：RANTES启动子区存在多个应答调控元件，但凝胶迁移实验及染色质免疫沉淀分析仅证实hrantes-m5、-m6( NF-kB1，NF-kB2)突变报告载体获阳性结果，表明NF-kB1，NF-kB2介入RANTES的调控。OA病变软骨部位有RANTES 高表达，培养的OA软骨细胞在施压状态呈现与压力相关的表达增高。研究结果表明RANTES启动子 NF-kB1，NF-kB2介入RANTES的调控,RANTES参与OA的病变过程,且与压力有关,这很好地解释了OA好发于负重关节。抑制通路可望阻断RANTES在OA的过表达,从而可能达到控制病变进展。