飞蝗几丁质合成酶基因启动子鉴定及其转录调控研究

Chitin synthase is one of the key enzymes responsible for chitin synthesis in insects. As this enzyme is absent in higher animals, it could be served as a potential target for developing safe and effective insecticides. In our earlier research, two cDNAs of LmCHS1 and LmCHS2 were cloned in Locusta migratoria. We will further study the structure and function of LmCHSs promoters and its mechanism of transcriptional regulation in this project. First, promoter sequences of LmCHS1 and LmCHS2 will be cloned using genome-walking technique and the characteristics will be analyzed using relative softwares. Second, the roles of promoter elements of LmCHSs will be determined by generating a series of 5′ deletions of promoters, constructing luciferase reporter plasmids, transfecting insect cells, and measuring the luciferase activities. Then, the putative binding sites of transcription factors will be confirmed by using the mobility shift assay and chromatin immunoprecipitation assay. Finally, the promoter activities and mRNA expression of LmCHSs will be determined after overexpression or silencing of transcription factors. By these means, we will illustrate the molecular mechanism of transcriptional regulation of LmCHSs. The results will enrich the theory system of the insect CHSs, and provide a reasonable basis for the effective management of L. migratoria.

几丁质合成酶（Chitin synthase，CHS）是昆虫几丁质合成过程中的关键酶之一，由于高等动物不存在该酶，被认为是设计安全高效杀虫剂的潜在靶标。本项目在已克隆得到飞蝗LmCHS1和LmCHS2基因cDNA序列的基础上，进一步深入探讨LmCHSs启动子的结构、功能及转录调控机制。主要内容包括：1）运用染色体步移法克隆LmCHSs基因启动子区，并用相关软件分析其特征；2）构建一系列CHSs基因启动子5′缺失片段的重组荧光素酶报告基因质粒，转染昆虫细胞，测定荧光素酶活性，确定各个启动子元件在基因转录调控中的作用；3）采用凝胶电泳迁移率和染色质免疫沉淀方法，对预测的转录因子结合位点进行验证；4）过表达和沉默关键转录因子后，检测CHSs基因启动子活性或mRNA表达变化，阐明飞蝗LmCHSs基因转录调控的分子机制。研究结果将丰富昆虫CHSs的理论体系，并为飞蝗的有效控制提供科学依据。

飞蝗是世界性重要农业害虫，目前在蝗虫防治工作中，仍以化学杀虫剂为主要手段，化学杀虫剂的大量使用，给生态环境带来严重污染，对人类的健康也构成威胁，研发环境友好型杀虫剂对防蝗治蝗工作具有重要意义。昆虫生长发育过程中的蜕皮现象依赖于体内几丁质合成和降解的精确调控，由于高等动物体内不含有几丁质，因此几丁质代谢途径中的关键酶被认为是设计新型农药的潜在靶标，正日益受到人们的关注。几丁质合成酶（Chitin synthase，CHS）是昆虫几丁质合成过程中的关键酶之一，本项目在已克隆得到飞蝗LmCHS1和LmCHS2基因cDNA序列的基础上，进一步深入探讨LmCHSs启动子的结构、功能及转录调控机制。主要研究结果如下：1） 已获得飞蝗 LmCHS1和 LmCHS2基因组gDNA序列和启动子区序列，并运用相关软件对其特性进行了分析；2）测定飞蝗4龄-5龄-成虫每一天的蜕皮激素20E滴度，并发现蜕皮激素调控飞蝗几丁质合成关键基因LmUAP1的表达，不影响LmCHS1和LmCHS2基因的表达；3）通过荧光素酶活性实验，确定转录因子HR3在LmCHS1基因转录调控中起重要作用；4）沉默关键转录因子HR3后，检测LmCHS1基因mRNA表达下调，几丁质合成量减少；5） LmCHS2基因受飞蝗进食的影响，饥饿处理后LmCHS2的表达被显著抑制，重新进食后，其表达量快速上调；6）LmCHS1和LmCHS2的多克隆抗体制备，目前已纯化获得大量目的蛋白。研究结果丰富了昆虫CHSs的理论体系，同时为进一步基于几丁质合成途径设计新型杀虫剂，实现蝗虫有效控制提供科学依据。本课题在国内外重要学术期刊发表研究论文5篇，其中SCI论文3篇，国内核心期刊2篇，主持人以第二参加人获得山西省科学技术奖自然科学类二等奖，培养硕士生2人。