胰腺癌细胞群通过活性氧系统相互竞争促进肿瘤进展的实验性研究

Background: Starvation of pancreatic cancer cells induced oxidative stress, a condition in which an imbalance results between the production and inactivation of reactive oxygen species, in tumor microenvironment. Reactive oxygen species (ROS) are mutagenic and may thereby promote cancer. The enhanced reactive oxygen species can best be described as double-edged swords: while they play an essential role in carcinogenesis via activation of oncogene and DNA damage; on the other hand, they contribute to cellular dysfunction and inhibition of proliferation in cancer cells under conditions of oxidative stress. Evidences reveal that there are some special subsets of pancreatic cancer cells in the bulk of tumor have the potential capability to resist the detriment of high level of ROS in the starved stress. Thus, we hypothesize that the expression of Nrf2, the transcript factor which has the function of antioxidant program, is increased induced by activation of K-Ras in these subsets of cells. Due to the enhanced Nrf2 expression, the harm of ROS for cell is eliminated. As the result of this ROS-antioxidant system, these special subset of pancreatic cancer cells gain the considerable advantage to survive in competition and the entire bulk of tumor cells have the evolution forward to more aggravation. Objectives:This study aimed to determine the function of the Nrf2 which induced by K-Ras in the different subset of pancreatic cancer cells under condition of starve stress in tumor microenviroment.

乏营养压力可诱导肿瘤微环境中不稳定的分子活性氧(ROS)，通过损伤DNA和激活癌基因的方式促进肿瘤发生，但是细胞内的高水平ROS实际上又抑制肿瘤生长。某些胰腺癌细胞能够抵抗乏营养胁迫，我们推测该抗性可能是由于部分癌细胞K-Ras突变诱导Nrf2表达，增加了细胞内抗氧化系统活性后，消减了ROS的毒性，从而使其在癌细胞亚群相互竞争中获得生存优势，在整体水平促进肿瘤演进。本研究应用临床病理、体外癌细胞亚群共培养以及裸鼠原位胰腺癌模型等手段，运用流式细胞术、激光共聚焦、qRT-PCR、Western blot、小动物活体成像等方法从组织学、细胞学、分子生物学等水平，通过双向调节Nrf2蛋白，探究其在肿瘤微环境乏营养压力下对细胞生存的选择作用，从另一角度理解胰腺癌发生进展机制，为治疗研究提供新依据。

在氧应激压力条件下，Nrf2和自噬可以保护肿瘤细胞在不利的肿瘤微环境中存活。由此，我们研究胰腺导管腺癌中Nrf2和自噬与氧应激所致细胞损伤的相关性，以及其与胰腺导管腺癌患者的临床病理特征关系。此外，我们探索氧应激条件下胰腺癌细胞所表达的Nrf2和自噬水平，揭示Nrf2通路和自噬的关系。收集从2008年1月至2012年12月在西安交通大学医学院第一附属医院住院手术并且有完整病例资料的72例胰腺导管腺癌患者的癌组织和癌旁组织标本。采用Western blot和免疫组化的方法检测组织标本的Nrf2和LC3蛋白的表达水平，MDA作为氧应激所致细胞损伤的标志分子。结果显示：癌组织中Nrf2和LC3的阳性表达率分别为84.72%和87.50%；相对于癌旁组织，癌组织中存在不同程度的Nrf2高表达（P<0.01）和LC3-Ⅱ高表达（P<0.01），且Nrf2和LC3的表达呈负相关；Nrf2的表达水平与原发肿瘤大小和有无远处转移有关（P<0.05），LC3的表达水平与原发肿瘤大小、肿瘤分化程度和有无远处转移有关（P<0.05）；相对于Nrf2和LC3单一高表达的胰腺导管腺癌患者，同时高表达Nrf2和LC3者具有较大的原发肿瘤，较多的远处转移和MDA阴性染色。在体外实验中，选择100umol/L为H2O2的最适作用浓度，利用流式细胞仪检测细胞内ROS水平，3-MA和CQ作为自噬不同阶段的抑制剂，Nrf2 siRNA用来抑制Nrf2的表达，自噬双标腺病毒感染细胞以监测细胞自噬潮，采用Western-blot和免疫荧光的方法检测下游分子变化。结果显示：外源性H2O2诱发细胞内ROS水平的上调；ROS可以引起的细胞内Nrf2表达量上升，且Nrf2由胞浆向胞核内聚集，同时可以提高细胞自噬相关蛋白Beclin1及LC3-Ⅱ的表达量，胞质内的LC3从正常培养的弥漫状态变为聚集的颗粒状；不同自噬抑制剂在不同阶段抑制自噬后，发现ROS进一步促进Nrf2通路的激活；siRNA抑制Nrf2的表达后，发现ROS进一步促进细胞自噬水平的升高。构建裸鼠胰腺癌原位移植模型，各组随机半数给予氯喹干预抑制细胞自噬，运用小动物活体成像技术动态观察，结果显示：同时抑制Nrf2通路和自噬的小鼠肿瘤体积较小，生长速度较慢，且发生转移较少。由此，Nrf2和自噬的联合抑制将会成为胰腺导管腺癌治疗的新策略。