硫化氢在肝癌细胞乏氧辐射耐受中的作用机制研究

It has been known that solid tumor always contain a hypoxic area due to chronic insufficiency in blood supply. The radioresistive hypoxic cells may result in unfavorable prognosis effects on tumor therapy.The sensibility of radiation and others DNA damage stresses can be promoted via the inhibition of SIRT1 (Sirtuin 1, SIRT1). Hydrogen sulfide(H2S), a new gasiform signaling molecule, which plays an important regulative action on cell proliferatioin and apoptosis in the ischemic and hypoxic diseases. Recently, We found that H2S played a protective effect for radiation damage on the hypoxic human hepatoma carcinoma cells. In this project, we will use hepatoma cell lines of HepG2 and Hep3B with different p53 phenotypes and their transfected cell lines without SIRT1 gene expression, named HepG2-SIRT1-shRNA and Hep3B-SIRT1-shRNA,treat the cells with siRNA and special inhibitors of target genes, measure irradiation damage with colony formation assay,micronuclei assay, flow cytometry assay, Western blot, Real time PCR, DNA electrophoresis, and investigate the radiation effect of endogenous and exogenous H2S on cell cycle, apoptosis, priliferation and DNA damage on hypoxic hepatoma cell. Moreover, the relation between H2S and SIRT1 and the role of H2S in hypoxia-induced radioresistivity including p53-apoptosis pathway, caspase-apoptosis pathway, and ATP sensitive potassium channels were also studied. The novel findings of this project will provide theoretical knowledge for new molecular target and new technique of tumor theray.

乏氧细胞是造成肿瘤对放疗抵抗甚至愈后复发的重要原因之一，抑制SIRT1表达能提高肿瘤对照射和各种DNA损伤因素的敏感性。硫化氢在缺血缺氧性疾病中对细胞增殖和凋亡发挥着重要的调节作用。近期发现，H2S在乏氧肝癌细胞辐射损伤中起保护作用,本课题拟以不同p53状态的肝癌细胞为研究对象，通过shRNA转染建立SIRT1缺失的细胞系，结合siRNA干扰和化学抑制剂，采用体外集落形成实验、微核试验、流式细胞术、Western blot、Real time-PCR和DNA电泳等方法检测乏氧条件下内外源性硫化氢对肝癌细胞受照后细胞周期、凋亡、增殖和DNA损伤等；以p53、Caspase凋亡通路和ATP敏感钾通道为切入点，研究硫化氢在乏氧辐射耐受中的作用机制，研究H2S与SIRT1在乏氧辐射耐受诱导的p53凋亡通路中的相互关系。项目研究成果将为发现新的肿瘤治疗靶点、发展新的肿瘤治疗手段提供理论依据。

乏氧细胞是造成肿瘤对放疗抵抗甚至愈后复发的重要原因之一，硫化氢在缺血缺氧性疾病中对细胞增殖和凋亡发挥着重要的调节作用，抑制SIRT1表达能提高肿瘤对照射和各种DNA损伤因素的敏感性。本课题拟以不同p53状态的肝癌细胞为研究对象，通过shRNA转染建立SIRT1缺失的细胞系，结合siRNA干扰和化学抑制剂，采用体外集落形成实验、微核试验、流式细胞术、Western blot、Real time-PCR和DNA电泳等方法检测乏氧条件下内外源性硫化氢对肝癌细胞受照后细胞周期、凋亡、增殖和DNA损伤等；以p53、Caspase凋亡通路和ATP敏感钾通道为切入点，研究硫化氢在乏氧辐射耐受中的作用机制，研究H2S与SIRT1在乏氧辐射耐受诱导的p53凋亡通路中的相互关系。研究结果显示：乏氧条件下，硫化氢可通过激活靶细胞的K+-ATP通道参与乏氧诱导的辐射抵抗；同时，受照靶细胞可通过抑制未受照旁细胞的内源性硫化氢的生成，介导Caspase3依赖途径诱导辐射旁效应的产生；此外，有氧条件下，H2S-CSE途径及其下游因子可促进肝癌细胞增殖；H2S 参与肝癌细胞受照后ROS的产生，ROS通过诱导旁细胞内自噬水平而介导旁效应的产生；SirT1通过自身脱乙酰化酶活性负向调节c-Myc蛋白的表达及其乙酰化水平，影响c-Myc蛋白的转录活性，进而抑制受辐射肝癌细胞P53蛋白的磷酸化水平，促进凋亡因子Bax的表达，抑制抗凋亡因子Bcl-2的累积，实现其对乏氧肝癌细胞辐射敏感性的特异性调节。同时，SirT1通过影响c-Myc蛋白的活性，调节胞内的活性氧水平，抑制乏氧肝癌细胞的辐射旁效应，降低正常肝细胞的DNA损伤。而正常肝细胞也可通过内质网应激反应激活PERK–p-eIF2α、ATF6–XBP-1 mRNA、IRE1α–XBP-1 mRNA splicing这3条重要的信号通路，抵御肝癌细胞辐射诱导的旁效应，保护自身免受染色体损伤并抑制细胞凋亡。因此，在肝癌的临床放疗中，干预SirT1基因表达可增强肿瘤细胞的辐射敏感性，同时，合理运用内质网应激反应介导的细胞保护机制，有助于增强肝癌放疗效率的同时将辐射旁效应对正常细胞的危害降至最低。 . 通过上述研究，较深入的了解了H2S在乏氧及有氧条件下辐射旁效应中的作用机制。这些结果的获得为发现新的肿瘤治疗靶点、发展新的肿瘤治疗手段提供理