环纹炭团菌挥发性有机化合物VOCs杀松材线虫活性机制研究

The study on nematocidal mechanism of volatile organic compounds (VOCs) against Bursaphelenchus xylophilus provides new insights into screening bioactive substances and relative genes against B. xylophilus. By using Annulohypoxylon sp. FPYF3050, this project centers on the nematocidal mechanism of VOCs. The GC-MS will be used to detect the VOCs, bioinformatics will be used for genomic information of the strain FPYF3050, and genetic transformation system in strain FPYF3050 will be finished by optimizing protoplast and transformation via PEG/CaCl2. On these bases, the detection of nematocidal activity of main component in the VOCs, prediction of gene clusters of the main component and construction of mutants of target genes will be carried out. The comparison of mutant and wild type strain will reveal the nematocidal mechanism of the strain FPYF3050. The establishment of genetic transformation system, which will be the genetic basis of Hypoxylon in screening bioactive substances and relative genes against B. xylophilus, will be the first in Annulohypoxylon. And the project will be the first one in revealing the nematocidal mechanism of fungal VOCs, which will provide new methods for screening bioactive substances and relative genes against B. xylophilus.

揭示挥发性有机化合物（VOCs）对松材线虫的杀线机制对于筛选可用于松材线虫防治的活性物质及基因具有重要的指导意义和应用价值。本项目以环纹炭团菌FPYF3050为材料，针对其具有强杀松材线虫活性的VOCs开展杀线机制研究。利用GC-MS获得VOCs组成；利用生物信息学获得该菌基因组信息；通过对该菌原生质制备、PEG/CaCl2转化的优化建立遗传转化体系。以此为基础，开展VOCs主成分杀线活性检测、杀线主成分代谢基因簇预测和缺失突变体的构建三部分研究，最终通过突变株与野生型的对比，初步揭示杀线机制。本项目将首次在环纹炭团菌中建立遗传转化体系，为炭团菌杀线活性物质和代谢功能基因的研究提供重要的遗传基础，也将是首个探索真菌VOCs杀松材线虫活性机制的研究，为杀线活性物质及相关功能基因的筛选提供新的途径和方法。

揭示挥发性有机化合物（VOCs）对松材线虫的杀线机制对于筛选可用于松材线虫防治的活性物质及基因具有重要的指导意义和应用价值。项目以环纹炭团菌FPYF3050为材料，利用顶空固相微萃取（HS-SPME）结合气相色谱-质谱联用（GC-MS）技术检测具有强杀线活性的VOCs的组成，对主成分的商业成品不同浓度、不同作用时间等条件下对松材线虫卵和J2等的杀线活性进行检测，初步探索VOCs中可能的杀线活性物质和机制。以FPYF3050的基因组为基础，筛选萜烯合酶序列，辅以荧光定量 PCR（qPCR）与气相色谱-火焰离子化检测法（GC-FID），根据基因表达量趋势与气体产量的趋势相结合，推算出可能的基因编码序列。通过对该菌原生质制备、PEG4000转化的优化建立遗传转化体系。结果显示，FPYF3050的强杀线VOCs的主成分是1,8-cineole，2，5，10和15（μg/mL）浓度下的商业成品在24h和48h的处理之后能够抑制39.8%~100%的线虫卵进入J2、对J2在各时间段均有82.9%以上的致死率，对混合龄期的松材线虫的也18.7%~91.9%的线虫死亡。鉴定出萜烯合成酶家族基因成员19个，初步推断Ann5和Ann15可能是控制1,8-cineole合酶表达的基因。建立了以溶壁酶为破壁酶、辅以神奇滤布过滤、山梨醇为稳定剂的原生质体制备方法，完成了以PEG4000介导的原生质体质粒转化，为进一步探索环纹炭团菌的杀松材线虫机制打下坚实的基础。初步确定1,8-cineole是环纹炭团菌释放的VOCs中对松材线虫起到关键杀线作用的物质之一。本项目首次在环纹炭团菌中建立遗传转化体系，为炭团菌杀松材线虫活性物质和代谢功能基因的研究提供重要的遗传基础，也是首个探索真菌VOCs杀松材线虫活性机制的研究，为杀线活性物质及相关功能基因的筛选提供新的途径和方法。