MALAT-1 RNA诱导细胞恶性转化的作用机制研究

逆转座子在人及小鼠细胞基因组中占42%，大多可转录产生大分子非编码RNA（ncRNA）。我们于2004年证实逆转座子RNA可通过与PSF蛋白相互作用调节基因表达，从而调控细胞分化及肿瘤发生发展过程。最近又发现5种来源于人的大分子ncRNA可与PSF蛋白相互作用发挥功能，将正常细胞转化为肿瘤细胞。MALAT-1 RNA就是其中效应较强的一种。在本项目中，首先鉴定和分析MALAT-1 RNA上的PSF蛋白精确结合位点，发现MALAT-1 RNA通过什么信息识别PSF蛋白；再鉴定MALAT-1 RNA－PSF蛋白相互作用诱导细胞转化采用的信号通路；最后将研究信号通路涉及到的关键靶基因在肿瘤发生发展过程中的作用。本项目的完成将使我们能系统深入认识大分子ncRNA诱导细胞恶性转化的作用机制；确认大分子ncRNA在肿瘤发生发展过程中的作用，还有助于解释表观遗传学研究中所遇到的一些重大生物学问题。

我们发现MALAT1 RNA中有1个293nt的区域（M1）可以与PSF蛋白相互作用。为验证M1 RNA与PSF蛋白结合对细胞增殖及肿瘤生成的影响，在小鼠正常成纤维细胞NIH/3T3和人黑色素瘤细胞yusac中过表达M1。通过细胞生长曲线、软琼脂集落形成及裸鼠体内成瘤实验，发现NIH/3T3-M1比对照细胞增殖速度快，发生了恶性转化并能在软琼脂上形成集落和裸鼠体内形成肿瘤；yusac-M1细胞的恶性化程度升高，和对照细胞相比在软琼脂上形成更大和更多的集落。采用shRNA方法构建了低表达M1 RNA的稳定细胞株yusac-M1 shRNA，细胞生长曲线、软琼脂集落形成实验表明，yusac-M1 shRNA细胞恶性化程度降低，比对照细胞更慢在软琼脂上形成集落。.为了研究与PSF蛋白结合的MALAT-1 lncRNA片段M1 RNA造成细胞恶性转化的原因，我们进行了染色质免疫共沉淀实验和半定量RT-PCR实验，结果显示M1 RNA能使PSF蛋白从与之结合的原癌基因GAGE6启动子区解离，M1 RNA高表达能促进GAGE6转录；相反地，M1 RNA低表达能抑制GAGE6转录。.多聚嘧啶结合蛋白(Polypyrimidine tract binding protein，PTB)可以调控基因可变剪接，影响细胞的发育、分化和癌症产生。已有的研究指出，定位于MALAT-1的RNA片段能与PTB蛋白结合，而PSF蛋白又是PTB蛋白相关剪接因子。为了验证MALAT-1 RNA、PSF蛋白和PTB蛋白的相互作用关系，我们运用蛋白质免疫共沉淀实方法，证明了内源性PSF蛋白与PTB蛋白的相互作用是靠RNA连接在一起的。通过RNA免疫共沉淀实验，发现了与PTB蛋白结合的MALAT-1特定序列M3。实验结果显示， MALAT-1 RNA上不同位置分别与PSF蛋白和PTB蛋白结合。PSF蛋白通过MALAT-1 RNA的介导调控PTB蛋白控制的RNA可变剪切。目前还没有任何其它关于蛋白通过ncRNA介导调控另一蛋白控制的RNA可变剪切的报道。.目前已发表2篇SCI论文，另外还有2篇论文（有标注）分别投到Science、JGG。