乏氧微环境下Foxp3在胰腺癌细胞中的表达调控机制及其功能研究

Foxp3, a critical transcription factor involved in immunoregulatory behavior, has been detected in pancreatic cancer cells, but the regulatory mechanism remains to be defined. Hypoxia is a common microenvironment of pancreatic cancer. We previously found that hypoxia induced the expression of Foxp3 through hypoxia inducible factor-1(HIF-1). Meanwhile, HIF-1 induced the expression of Foxo1, a upstream transcription factor of Foxp3. Therefore, we postulate that hypoxia might regulate the expression of Foxp3 through HIF-1/Foxo1 Pathway. Foxp3 has been confirmed to directly interact with HIF-1, and we also found that Foxp3 may work as a co-activator with HIF-1 to regulate the expression of CCL28, thus promoting the migration of Treg cells toward tumor tissues. Moreover, the immunoregulatory role of Foxp3+ pancreatic cancer cells targeting activated T cells and the clinical significance need to be elucidated. The aim of this study is to investigate the regulatory mechanism of Foxp3 in pancreatic cancer cells， the function of Foxp3+ pancreatic cancer cells in Treg migration and T cell immunosuppression and the clinical significance of Foxp3 expression in pancreatic cancer cells. Through these studies, we try to further understand the mechanism of immune evasion in pancreatic cancer cells and identify new markers for prognosis.

免疫调节的重要转录因子-Foxp3在胰腺癌细胞中表达增加,并参与胰腺癌组织的免疫逃逸行为，但其表达调控机制尚未阐明。乏氧是胰腺癌组织重要微环境，我们前期研究提示，乏氧可通过乏氧诱导因子HIF促进Foxp3的表达，同时HIF可促进Foxp3上游转录因子Foxo1表达，推测存在乏氧条件下的HIF-1/Foxo1/Foxp3调节通路；Foxp3已被证实可与HIF-1蛋白直接结合，我们预实验提示Foxp3可能和HIF-1形成共活化转录因子，促进趋化因子CCL28的转录，有可能参与Treg细胞在肿瘤组织中的浸润；乏氧微环境下Foxp3+胰腺癌细胞对活化T细胞的免疫调节作用及Foxp3表达的临床意义值得进一步明确。本研究拟探讨胰腺癌Foxp3在乏氧条件下的表达调控模式，参与Treg浸润和T细胞调节功能的机制及临床意义，为深入了解胰腺癌的免疫逃逸机制，探索预后评价的免疫指标提供依据。

胰腺癌肿瘤微环境中，以乏氧诱导因子为核心的调控轴，参与肿瘤细胞增殖、转移、耐药及微环境重塑等多种生物学行为。本课题发现胰腺癌细胞中乏氧诱导因子HIF-1α的高表达通过FOXO1促进氧自由基的清除进而促进肿瘤耐药的发生，并同时调控肿瘤源性FOXP3（cancer-FOXP3, c-FOXP3）的表达，参与胰腺癌局部免疫微环境重塑，影响患者预后。FOXP3是CD4+CD25+调节性T细胞的核心转录因子，近期研究提示，FOXP3也可表达于多种肿瘤细胞。我们研究发现FOXP3在胰腺癌细胞中出现特异性表达升高，研究肿瘤源性FOXP3的功能，可能为胰腺导管腺癌的靶向治疗提供新的靶点。本课题明确了c-FOXP3在胰腺导管腺癌组织及细胞中的表达水平、功能效应、以及背后的调控机制；从临床组织、细胞分子及动物水平深入探索了胰腺癌中c-FOXP3的功能与意义。首先，通过组织学免疫组化染色，明确了c-FOXP3蛋白在胰腺导管腺癌组织中的表达水平，发现其表达水平与Treg细胞在肿瘤局部富集程度呈正相关，且c-FOXP3表达与Treg细胞聚集共同影响患者的不良预后。进一步，通过多种体内、外实验探索c-FOXP3对肿瘤细胞的直接作用及其对肿瘤免疫微环境的影响。同时，利用人源外周血单个核细胞与调节性T细胞建立肿瘤细胞与淋巴细胞共培养系统，检测肿瘤源性FOXP3表达与Treg细胞的增殖、凋亡、诱导转化以及对Treg细胞的趋化能力的影响。进一步通过构建裸鼠胰腺癌原位成瘤模型，同时由鼠尾静脉注射人外周血单个核细胞(PBMCs)，通过体内模拟实验验证c-FOXP3促进Treg细胞向胰腺癌局部微环境的趋化募集的过程。深入探索胰腺癌细胞趋化Treg的分子机制，应用基因芯片、ELISA等方法筛选并验证c-FOXP3促进肿瘤细胞分泌趋化因子CCL5，应用CHIP及双荧光素酶报告基因等实验手段阐明c-FOXP3对CCL5的调控机制。进一步通过体外阻断回复实验明确CCL5在c-FOXP3引起的Treg细胞向胰腺癌局部微环境的趋化募集过程中的核心作用，最后通过构建C57BL/6免疫正常鼠移植瘤模型，通过体内阻断实验，进一步阐明c-FOXP3通过CCL5引起Treg细胞向胰腺癌肿瘤微环境募集的病生理过程。这为揭示胰腺癌肿瘤微环境免疫重塑提供了新思路，同时也为胰腺导管腺癌联合免疫调节等靶向治疗提供了理论依据。