禽冠状病毒（IBV）H120、M41、SAIBk株反向遗操作和毒力相关基因研究

禽冠状病毒（禽传染性支气管炎病毒IBV）是冠状病毒的代表种，是RNA病毒中基因组最大的病毒。国内外还没有成功建立IBV反向遗传操作技术，IBV毒力的基因不清楚。本研究以IBV 标准弱毒株H120、标准强毒株M41和申请者自主分离鉴定自中国的SAIBK株为研究对象，采用与国外现有研究报道不同的体外直接转录方法，对IBV病毒进行反向遗传操作研究，获得拯救病毒cDNA株，建立IBV反向遗传操作技术。获得拯救的H120-RE cDNA株，可以不必要去除毒力基因，直接构建成禽用疫苗载体，用H120-RE cDNA株作为新城疫（ND）疫苗载体，是基于该病毒易在呼吸道定殖，具有基因容量大，安全性好等优点。以3株病毒的反向遗传拯救株为基础，进行基因置换、缺失，对比重组株和母本毒株的毒力变化，寻找出IBV的毒力相关基因。毒力基因的研究和确定，对于IBV强弱毒检测，疫苗研究及抗病毒策略等是必须解决的科学问题。

在该课题的资助下，完成了以下研究工作：1、禽冠状病毒（IBV）H120毒株全基因组测定分析。对禽冠状病毒（IBV）H120毒株全基因组进行分段克隆测序拼接，获得H120全基因组，Genbank登陆号FJ888351。对H120全基因组进化分析发现H120与ZJ971、M41的亲缘关系较近，与中国分离株亲缘关系远；重组分析表明IBV毒株H52-China，KQ6、SAIBK、Ark DPI可能是由H120相关的重组事件产生，说明疫苗间重组情况严重。2、禽冠状病毒（IBV）H120，M41，SAIBK毒株反向遗传构建。使用改进的NO see’M技术将IBVM41，H120，SAIBK分为12-13个片段设计引物进行PCR扩增， 5’UTR引入T7启动子，3’UTR端引入poly（A），引物两端分别引入BsaⅠ，BsmbⅠ酶切位点，将各片段克隆在pMD19-T中，然后将各个片段酶切回收纯化，采取多片段同时连接获得IBVM41、H120、SAIBK全长cDNA。通过与N转录物电击转染BHK-21细胞，接种鸡胚，收获鸡胚尿囊液。鉴定具有典型IBV特性，拯救毒株命名为R-M41、R-H120、R-SAIBK。3、R-M41、R-H120、R-SAIBK生物学特性研究。反向遗传拯救株R-M41、R-H120、R-SAIBK经鉴定含有人工引入的沉默突变，电镜下为典型冠状病毒粒子，拯救毒株HA,EID50、鸡胚中生长曲线与亲本毒株一致。 表明R-M41、R-H120、R-SAIBK具有亲本毒株相似的生物学特性。4、禽冠状病毒IBV病毒毒力基因寻找。通过对IBVH120，M41，SAIBK进行比对，寻找基因组差异序列，并以H120，M41，SAIBK毒株反向遗传体系，互为对照，结合同源重组技术确定IBV S基因与病毒力无关，禽冠状病毒非结构基因部分可能与病毒毒力有关。5、H120做为病毒载体可行性研究。研究表明H120做为病毒载体具有可行性，稳定性，安全性。能诱导SPF鸡产生强烈体液反应，具有对标准攻毒毒株85%免疫保护水平，与H120疫苗毒株一致，具有作为疫苗载体的可行性。6、本研究发表SCI论文9篇、申报专利5项。全面完成自然基金项目要求的内容，进一步研究获得国家863“家禽重要病毒病基因工程疫苗创制及生产工艺优化研究”的资助。