陆地棉谷胱甘肽硫转移酶亚基编码基因GhGST的抗黄萎病功能研究

Cotton Verticillium wilt is an important disease in cotton production. Resistance gene cloning and genetic transformation are much essential for improvement of the cotton resistance. A tau Glutathione S-transferase (GST) subunit encoding gene, named GhGST, was isolated in our preliminary experiments. The marked Verticillium wilt resistance was observed in transformed tobacco plants. In this study, the functional analysis of the gene will be furtherred, to analyze the temporal and spatial expression in resistant Gossypium barbadense, resistant G. hirsutum and susceptible varieties; to construct GhGST-pBI121 overexpressing vector and RNAi recombinant vector and transform cotton for analyzing the resistance of transgenic plants under Verticillium dahliae stress; to investigate the effects of GhGST overexpression on ethylene(ET), salicylic acid(SA) and hydrogen peroxide(H2O2), and verify how the gene functions in cotton Verticillium wilt resistance. The results will provide important scientific basis to cotton breeding of Verticillium wilt resistance in theory and practice.

棉花黄萎病是生产上的重要病害，抗病基因的克隆与转化对改良棉花黄萎病抗性具有重要意义。项目组在前期工作中，克隆了tau类谷胱甘肽硫转移酶亚基编码基因GhGST，初步研究表明转GhGST基因烟草对黄萎病具有很好的抗性。本项目拟对已克隆的GhGST基因进行深入的功能分析。研究GhGST基因在海岛棉抗性品种、陆地棉抗感品种中的时空表达规律；构建GhGST基因的超表达载体和RNAi载体，获得转基因棉花，研究其黄萎病菌胁迫下基因表达和黄萎病抗性反应；进一步分析GhGST基因超表达对抗病相关内源性激发因子乙烯、水杨酸和过氧化氢表达量的影响；明确GhGST基因对棉花黄萎病的抗病作用及机制。研究结果对棉花抗黄萎病育种具有重要的理论和应用价值。

我国是世界上棉花贸易进口和纺织品出口第一大国，常年植棉面积5000万亩左右。生产上，黄萎病是影响棉花产量和品质的重要病害之一，培育抗病品种是防御黄萎病最经济、高效、环境友好的途径，而克隆抗病基因、解析抗病机制是培育抗病品种的前提。. 本研究以GhGST（EU074792）基因为基础进行了棉花遗传转化；黄萎病菌胁迫下的GhGST基因时间表达特异性分析；干涉GhGST基因条件下抗病棉花品种、转GhGST基因烟草植株在黄萎病菌胁迫下的抗性反应及GhGST在植株体内对H2O2微平衡的调节机制研究。. 结果表明黄萎病菌胁迫15天后，VIGS-GhGST较对照植株出现明显黄萎病症状。病级统计证明GhGST基因表达对黄萎病菌具有明显抗性。根部性状扫描首次证明GhGST基因表达能够促进棉花根的发育。茎组织显微观察和黄萎病菌复苏培养试验证明GhGST基因表达对黄萎病菌在棉株体内侵染和繁殖具有抑制作用。转GhGST基因烟草植株对黄萎病菌抗性较对照明显增强。双因素统计分析证明黄萎病菌胁迫能够显著提高转基因植株GhGST基因表达量（P value 3.37×10-6 < 0.01）。胁迫处理21天后，转基因植株未明显表现黄萎病症状、生长健壮。而野生型烟草表现出严重的黄萎病症状。病级调查显示GhGST基因表达能够显著增强烟草黄萎病抗性。黄萎病菌复苏培养结果显示转GhGST基因植株抑制了黄萎病菌侵染的数量。. 在水和黄萎病菌胁迫处理不同时间点进行H2O2含量、CAT和POD表达量测定。结果显示，黄萎病菌胁迫下，可重复双因素统计分析发现棉花CK及VIGS植株H2O2含量、CAT和POD表达量升高，且存在显著差异，P值依次为1.65×10-3 <0.01，4.48×10-4 <0.01，1.12×10-4 <0.01。但VIGS植株表达量低于CK植株。可重复双因素统计分析发现野生型烟草及转基因超表达植株H2O2含量、CAT和POD表达存在显著差异，P值依次为2.4×10-4 <0.01，3.6×10-9 <0.01，1.58×10-7 <0.01（表6）。但是转基因植株表达量高于CK植株。. 综上所述，通过正、反试验首次证明GhGST基因表达能够调节植株体内H2O2微平衡，增强棉花黄萎病抗性，GhGST基因可以作为棉花黄萎病抗性育种基因资源。