促甲状腺激素（TSH)在胆固醇合成中作用机制的研究

长期以来认为甲状腺功能异常时胆固醇水平的改变是甲状腺素（TH）作用的结果，但临床上一些现象如亚临床甲减（TSH升高，TH不变）时胆固醇也升高,而继发性甲减（TSH和TH都降低）时胆固醇水平降低均无法单纯用TH的作用解释。是否TSH在胆固醇调节方面也起重要作用呢？肝脏是调节胆固醇代谢的最重要脏器，TSH是否在此有一定的作用呢？国内外至今未见相关报道。.我们的前期研究已明确肝脏存在TSH受体，本项目首先采用TSH体外刺激正常的人肝细胞，检测胆固醇合成的关键酶-HMG-CoA还原酶基因转录、蛋白表达和活性水平及细胞内胆固醇含量的变化。其次采用药物和切除甲状腺手术的方法分别建立甲减模型鼠，探讨内源性和外源性TSH对肝脏HMG-COA和胆固醇的调节作用，及对血清胆固醇水平的影响。.该课题是一项具有较强的创新性研究，对开拓认识TSH的生理作用以及加深对甲状腺相关疾病的认识具有重要理论与实用价值

研究目的：. 通过研究TSHR介导的TSH作用，揭示TSH在胆固醇合成中的可能机理。通过TSH刺激肝细胞cAMP/PKA/CREB信号途径的实验研究，揭示TSH增加肝细胞HMGCR的表达的作用机制。.研究方法：.　　1、为了研究肝细胞表达功能性TSHR,实验用牛TSH、胰高血糖素或福斯考林刺激L-02、培养的人原代肝细胞和小鼠胚胎肝细胞系BNL细胞，检测cAMP释放。2、在体外实验，用牛TSH处理肝细胞，检测细胞HMGCR表达。检测TSH对HMGCR剂效性和时效性关系。3、为表明TSH影响肝细胞HMGCR的表达是通过TSHR作用的，实验用人单克隆抗体CS-17与TSH竞争结合TSHR。检测cAMP释放。另外，用慢病毒介导的RNA干扰病毒感染培养的肝细胞，敲除肝细胞TSHR表达，检测TSH刺激后cAMP的释放和HMGCR的表达的变化。4、为了探讨TSH诱导上调肝细胞HMGCR 表达是通过cAMP信号系统，用腺苷酸环化酶抑制剂SQ22536预孵肝细胞，再用TSH刺激肝细胞，检测cAMP和HMGCR变化。5、为了证实TSH刺激增加肝细胞HMGCR mRNA水平是通过增加HMGCR启动子的活性作用实现的，本研究设计相应HMGCR启动子的一个DNA片段，与荧光素酶基因融合，构建荧光素酶报告基因，然后转染到L-02细胞。在不同处理条件下，测定荧光素酶活性。6、通过ChIP实验定量分析TSH刺激L-02细胞激活HMGCR转录活性。7、为进一步明确TSH是否对CREB/DNA结合活性有影响，从L-02细胞提取核蛋白进行了EMSA实验研究。.研究结果：肝细胞膜表达具有功能活性的TSH受体；TSH增加肝细胞HMG-CoA还原酶（HMGCR）的表达和活性；TSH刺激增加L-02细胞内总胆固醇（TC）含量；TSH诱导肝细胞HMGCR表达依赖于TSHR；TSH通过cAMP/PKA/CREB信号通路上调肝细胞HMGCR表达；TSH增加血清TC水平。.　结论： 本研究通过体外和体内实验，证明了TSH可以增加肝脏胆固醇合成的关键酶HMGCR的表达，这种作用主要是通过cAMP/PKA/CREB信号通路实现的，且依赖于肝细胞膜上的TSHR。研究揭示了高胆固醇血症一个新的发病机理，尤其是甲减相关的高胆固醇血症。本研究对于甲减相关的高胆固醇血症有重要的病理生理意义和临床应用价值。