RPE细胞VEGFR2在糖尿病小鼠视网膜外屏障损伤中的作用机制

The retinal pigment epithelium (RPE) cells constitute the outer blood- retina barrier(BRB) and plays an important role in diabetic retinopathy. However, the damage mechanism is still unclear. We find that the leakage of outer blood-retinal barrier there are significantly reduce in RPE-specific VEGFR2 gene knockout diabetic mice compare with normal mice,and we also find that the expression of tight junction protein in the VEGFR2 gene knockout RPE cells is reduced. Therefore, our hypothesis is that RPE cell-derived VEGFR2 play an important role in the outer blood-retinal barrier breakdown in diabetic mice. To test this hypothesis, we will observe the change of VEGFR2 expression in RPE in diabetic mice and evaluate the damage degree of outer blood-retina barrier by analyze the leakage of different molecular weight dextran; To explore the molecular mechanism,we will block the ERK or JNK or PI3K or Akt protein in ARPE-19 cell line in high concentration glucose medium, then we wil check the expression of tight junction proetin between RPE cells inculding occludin、 ZO-1、Caludins and JAMs.This research will help us understand the damage mechanism of RPE cell-derived VEGFR2 breakdown the outer blood-retinal barrier in diabetic mice, it will provides a new strategy for the treatment of diabetic retinopathy.

视网膜色素上皮（RPE）细胞构成的血-视网膜外屏障损伤在糖尿病视网膜病变中起重要作用。然而，其损伤机制仍不清楚。我们发现：条件性敲除RPE细胞血管内皮细胞生长因子受体2（VEGFR2）基因，会显著减轻糖尿病小鼠视网膜外屏障渗漏，从该小鼠分离的原代RPE细胞因高渗糖导致的细胞间连接蛋白损伤会减轻。为此，我们提出：RPE细胞VEGFR2在糖尿病小鼠视网膜外屏障损伤中起重要作用。为验证假设，继续观察糖尿病小鼠RPE细胞VEGFR2的表达，通过外屏障对不同分子量大小荧光素标记的葡聚糖的通漏能力来评估其损伤程度；利用视网膜色素上皮细胞株ARPE-19，于高渗糖条件下阻断信号通路上ERK、JNK、PI3K、AKT等蛋白，检测RPE细胞间Occludin、ZO-1、Caludins、JAMs等连接蛋白的表达，明确VEGFR2引起糖尿病视网膜外屏障损伤的分子机制，为治疗糖尿病视网膜病变提供一种新思路。

糖尿病视网膜病变是糖尿病最为常见的眼部并发症之一。其发生是多种因素协同作用的结果，是一个非常复杂的病理过程。血-视网膜外屏障的破坏是DR的重要病理特征，是导致非增殖性DR向增殖性DR转变的关键步骤。项目申请团队经过4年时间完实验研究，针对高糖对RPE细胞上VEGFR2表达的影响，RPE细胞上VEGFR2信号通路对外屏障的作用及VEGFR2调控RPE细胞间紧密连接蛋白的分子机制进行了较深入的研究。主要实验结果如下：.1．由于VEGF是引起糖尿病视网膜RPE渗漏的重要因子，本项目聚焦RPE上VEGFR2信号通路进行了研究。利用shRNAs敲除ARPE-19或原代RPE细胞上ADP-核糖基化因子6。 经高糖处理的RPE细胞显示细胞增加迁移、脱细胞通透性、EMT和VEGF表达。 而阻断VEGFR2可抑制高糖诱导的ARF6产生的效应。敲除 ARF6或GEP100可导致抑制高糖诱导VEGFR2通路的失活。如仅敲除ARF6， 则降低了高糖诱导的VEGFR2内化。 整个研究表明： GEP100/ARF6可调节VEGFR2信号，促进高糖诱导视网膜色素上皮间充质转换和细胞通透性。 .2.本研究探讨了高糖条件下miR-132对人视网膜色素上皮ARPE-19细胞通透性和移动性的影响及其机制。 在正常和高糖条件下培养ARPE-19细胞,我们发现HG处理的ARPE-19细胞表现出显著增加miR-132的表达，减少紧密连接蛋白occludin and E-cadhe rin的表达，occludin蛋白mir-132的直接靶点，高糖条件下可通过JAK/STAT3信号通路调节细胞迁移率和通透性。.3. 利用氧诱导缺血性视网膜病变小鼠模型研究发现： ARPE-19在缺氧条件下VEGFR2-mRNA及蛋白表达水平升高，Occludin则反之，两者表达呈负相关。沉默ARPE-19中VEGFR2的表达后，Occludin的表达水平上升，相应的ARPE-19屏障渗漏显著降低；相反过表达VEGFR2后，Occludin表达水平下降，相应的ARPE-19屏障渗漏显著升高。即缺氧条件下RPE细胞VEGFR2表达升高，并可通过负向调控Occludin的表达促进视网膜RPE屏障渗漏。.以上的研究结果可为DR治疗提供新的策略，为治疗糖尿病引起的视网膜病变提供新靶点和新技术平台，研究成果将具有一定的理论意义和应用价值。