蛋白酶类定植因子HpPrtC在幽门螺杆菌致病中的作用与作用机制研究

Helicobacter pylori is an important carcinogenic bacterium in stomach. Protease produced by H. pylori has a critical role on enhancing its invasiveness. HpPrtC is a novel protease expressed by H. pylori with an identity lower than 40% with other proteases. As it is necessary for bacterial colonization, it could be looked as a colonization factor in the bacterial pathogenic progress. However, its detailed pathogenic function and mechanism remained unclear. This project is intended to research the function and mechanism of HpPrtC. First, comparison between the wild type and the mutant ΔHpPrtC will be performed on their transmigration through human fibroblasts monolayer, infection rate to Mongolian gerbil, and the destruction of collagen in these processes. These results will clarify the function of HpPrtC as a colonization factor through collagen degrading. Then, the enzymatic hydrolysis mechanism of recombinant HpPrtC will be investigated based on microscopic observation of its collagen degradation pattern and analysis of its cleavage sites on collagen. According to the zymolytic preference, peptide inhibitors of HpPrtC will be designed to further confirm the pathogenic mechanism of H. pylori mediated by HpPrtC, which will also lay a foundation for development of new drugs. This project will clarify the pathogenic mechanism of HpPrtC, a novel colonization factor, on its role in affecting the invasiveness of H. pylori through degrading collagen. The results will further enrich the pathogenic mechanism of H. pylori and provide theoretical basis for development of new methods to prevent and therapy H. pylori infection.

幽门螺杆菌是重要的胃部致病菌，与胃癌发生密切相关。蛋白酶是决定该菌侵袭力的关键因素。HpPrtC是幽门螺杆菌表达的一种新型胶原蛋白酶，与已知蛋白酶序列一致性低于40%，且能显著影响细菌定植能力，但其作为定植因子的作用机制还不清楚。本项目拟在前期基础上深入研究HpPrtC在幽门螺杆菌致病中的作用与作用机制。首先通过检测基因敲除株ΔHpPrtC体外对细胞层的穿过能力、体内对小鼠的侵袭力、以及在此过程中细菌对胶原蛋白的降解情况，明确HpPrtC能够通过降解胶原蛋白影响幽门螺杆菌的定植能力。然后通过分析HpPrtC的酶解过程及酶切位点，探明其对胶原蛋白的酶解机制。最后根据酶切位点设计和筛选小肽抑制剂，进一步确证HpPrtC的作用机制，并为后续药物的开发奠定基础。本项目研究结果将揭示HpPrtC在幽门螺杆菌定植过程中发挥的作用及其机制，为进一步完善该菌的致病机理，开发其防治新方法提供理论依据。

蛋白酶是致病菌侵袭力的重要组成部分，可以通过破坏宿主组织的完整性帮助细菌完成定植。幽门螺杆菌（Hp）是引起人类胃部疾病的主要致病菌，与慢性胃炎、胃溃疡、胃腺癌以及黏膜相关性淋巴组织淋巴瘤等疾病密切相关。据分析Hp表达一种新型胶原蛋白酶HpPrtC，对其定植起关键作用，但机制尚不清楚。本项目以HpPrtC为研究对象，对其酶学性质、酶解机制及其在Hp致病过程中发挥的作用进行了研究。首先通过诱导条件调整及密码子优化，获得了具有稳定活性的异源表达重组蛋白HpPrtC，并筛选出快速且准确性高的胶原蛋白酶活检测方法；在此基础上，我们检测了HpPrtC的基本酶学性质，包括其最适酶活温度、最适pH、底物特异性、对抑制剂及不同金属离子的敏感程度、热稳定性等指标；之后通过SEM观察了该酶对胶原纤维的降解模式，以期结合液相与质谱联用分析其酶切位点及偏好性，解析其对胶原蛋白的酶解机制；同时构建了HpPrtC敲除株ΔHpPrtC，通过Transwell实验检测了该胶原蛋白酶缺失对细菌穿过胶原蛋白层的影响，证实了该酶可以通过降解胶原蛋白影响Hp侵袭力；而通过对比敲除株和野生株对胃上皮细胞GES-1的增殖和活力影响，还发现该基因对细胞有潜在的毒害作用。本项目对HpPrtC酶学性质的研究丰富了胶原蛋白酶库的信息，并有助于HpPrtC抑制性产品的开发，以期为抑制Hp的定植提供思路；而HpPrtC致病机制的研究将有助于进一步阐明Hp的致病机理。.在构建Hp敲除突变株的过程中，我们对其遗传操作进行了进一步优化，构建了基因敲除质粒载体pSJHK和pSJHC，开发了基因无痕敲除方法，并优化了质粒转化的实验条件。此外，我们发现一个新的影响Hp致病作用的基因位点hp0788，该基因编码一个外膜蛋白HofF。通过对比该基因敲除株与野生菌株感染细胞后对细胞活性及凋亡的影响，结合转录组分析，初步揭示了hp0788参与Hp感染细胞的作用机制，为深入解析Hp与受体细胞相互作用提供了新的切入点。