运用CRISPR-Cas9基因编辑技术研究多基因对造血干细胞协同作用

Gene knock out mouse model has been widely applied in the study of specific genes for the function of hematopoietic stem cell (HSC), but the method is difficult for the multiple genetic modifications at the same time quickly. CRISPR-Cas9 genetic editing technique provides the possibility for the multiple genetic editing on the HSC level. This study will apply the efficient CRISPR-Cas9 technique in the primary mouse HSC and obtain the HSC with variant genotyping through the self-renewal in vivo. Using this method, for the one hand, we can demonstrate the effect of TGF-b on the function of HSC through different TGF-b receptor knock out HSC, and on the other hand, we will try to establish the B-ALL mouse model through the knock out and/or overexpression of multiple gene modification (for example the deletion of PAX5) and illustrate the combinatorial effect of genes in the initiation and development of B-ALL. This project will improve the operation procedure of CRISPR-Cas9 technique in the primary HSC, find out the combinatorial effect of multiple genes on physiological regulation and pathological transformation of HSC, which will provide reasonable approach and useful information for the patient-specialized disease model and precision medicine.

特定基因对造血干细胞（HSC）生物学功能影响的研究体系多是利用基因缺陷动物模型而实现，但这些方法难以快速对多个基因同时进行修饰。CRISPR-Cas9技术为在HSC水平进行多个基因功能研究提供了可能。本研究将高效的CRISPR-Cas9技术应用于以小鼠原代HSC，利用体内环境中HSC自我更新的特性获得携带不同基因型的HSC，一方面通过敲除不同亚型的TGFβ受体揭示TGFβ对HSC周期调控的作用机制，另一方面，通过CRISPR-Cas9技术获得携带与B-ALL发生相关的不同组合基因修饰的HSC（如PAX5缺失），从而构建B-ALL疾病模型，明晰不同的遗传学修饰在发病过程中的作用。本项目的实施将优化在原代细胞上进行CRISPR-Cas9的操作体系和流程，揭示多基因协同作用对HSC生理调控和恶性转化中的作用，为构建针对病人的个体化疾病模型及寻找精准医疗的诊治靶点提供有效的途径和坚实的研究基础。

CRISPR/Cas9是一种常用的基因编辑技术，已广泛用于小鼠及人细胞的基因编辑的研究。原代造血干细胞（HSC）由于其细胞数量稀少，难以被携带大片段的外源基因感染，因此在原代HSC的基因编辑非常困难。本课题首先利用Cas9-EGFP敲入小鼠与Cre-ER小鼠杂交从而产生可诱导表达Cas9蛋白的Cas9-EGFP/Cre-ER转基因小鼠模型。利用流式细胞术分选该小鼠原代HSC1以及HSC2细胞细胞，使用sgPax5-Crimson慢病毒进行感染以敲除Pax5基因，结果显示慢病毒的感染效率能够达到95%。将感染后的细胞DNA进行了靶向sanger测序，结果显示基因敲除效率为97.85%。接着将感染后细胞移植入致死剂量照射的受体，检测HSC敲除Pax5基因后对重建情况及谱系分化的影响。结果显示：Pax5敲除后HSCs在受体外周血中B细胞显著下降，髓系细胞以及T细胞的比例无显著变化。Pax5敲除后骨髓中HSC1及HSC2来源的B细胞比例明显上升（主要为Pro-B细胞）伴有髓系细胞比例下降，T细胞无显著变化。提示HSC细胞敲除Pax5基因导致B系前体细胞在骨髓中阻滞，不能分化为成熟的B细胞。为了构建小鼠B-ALL疾病模型，我们通过在原代HSC过表达N-myc基因的方法来诱导。首先分选B6小鼠（Ly5.2， CD45.2）骨髓中的HSC和造血祖细胞（HPC）。上述细胞感染N-Myc病毒后将所有细胞移植给受致死剂量照射的B6小鼠（Ly5.2，CD45.2）。移植后每两周检测外周血中供体来源细胞的重建情况。结果显示N-myc基因在不同HSC和HPC过表达均可诱导白血病的发生，同种HSC/HPC过表达N-myc基因后会发生B-ALL、T-ALL、AML、以及AUL(未分化白血病)等不同类型的白血病。全基因组测序结果发现外源性N-myc载体序列可整合在不同的基因组位点，且整合位点附近上调/下调基因多和相应的造血细胞谱系分化密切相关。.本研究建立了一种高效且便捷的在HSC水平进行基因编辑的方法，利用该方法揭示了Pax5基因敲除导致HSC向B细胞发育阻滞在pro-B阶段。N-myc过表达的研究提供了一种新的小鼠模型，即多种起源细胞的同种突变可诱导多种白血病的发生，这对于研究临床N-Myc突变相关白血病发病机理以及靶向药物开发提供了一定的参考价值。