基于纳米胶囊的Cas9/sgRNA复合物的高效递呈与调控研究

The CRISPR/Cas9 system is a versatile tool for precise gene editing, and has become one of the disruptive biotechnologies that can change the future. However, the frequently used cellular delivery methods result in long-lasting expression of CRISPR/Cas9 and the unpredictable off-target effects may lead to serious consequences in the clinical trails for cancer therapy. Delivery of Cas9 protein along with a guide RNA (sgRNA) provides a promising strategy, which allows for quantitative regulation of its intracellular content and time of action. Nanocapsule is a technique that can be used to enhance the stability and cell-penetration ability of proteins by forming a functionalized shell. As an efficient tool for biomacromolecule delivery, the nanocapsule technology has many advantages over other approaches. Our previous study has confirmed that nanocapsules were capable of delivering proteins efficiently into human primary T cells, with much higher efficiency than plasmids transfection by using commercial liposomes. In this project, based on the nanocapsule technique, we intend to achieve the efficient delivery and regulation of the Cas9/sgRNA complex, and quantitatively study the relationship between the delivery parameters and the gene editing efficiency as well as the off-target effect. As China has become the first country to conduct a clinical trial of CRISPR/Cas9 for T cell cancer therapy, this project can contribute to a better understanding and safety improvement of the CRISPR/Cas9 system.

CRISPR/Cas9基因编辑已成为能够改变未来的颠覆性生物技术之一，然而目前常用的递呈策略会引起这一系统在细胞内持续表达，不可预知的脱靶效应可能在肿瘤临床治疗中导致严重后果。较为理想的策略是直接递呈Cas9蛋白和sgRNA复合物，从而实现对其胞内含量和作用时间的定量调控。纳米胶囊是一种在蛋白质表面形成功能化壳层的技术，能够显著增强蛋白质的稳定性和细胞穿透能力，将其作为生物大分子的递呈工具具有诸多优点。我们的前期研究表明纳米胶囊能够高效递呈蛋白质至人原代T细胞，其递呈效率远高于商用脂质体对质粒的转染。基于纳米胶囊技术，在本项目中我们拟实现对Cas9/sgRNA复合物的高效递呈与调控，进而定量研究递呈参数与基因编辑效率及脱靶效应的关系。在我国率先应用CRISPR/Cas9技术进行T细胞肿瘤临床治疗的背景下，本项目的顺利开展对于认识并提升CRISPR/Cas9的安全性具有重要意义。

针对CRISPR/Cas9基因编辑工具的高效递送与精准调控是细胞治疗领域的重要研究方向。以重组病毒和质粒作为递送载体可能导致基因编辑元件在细胞内持续表达，增加脱靶效应。较为理想的策略是直接递送Cas9蛋白和sgRNA复合物，实现对胞内含量、作用时间及基因编辑活性的定量调控。然而Cas9/sgRNA复合物三维结构复杂，对其进行高效递送是一项巨大挑战。纳米胶囊是一种优化蛋白质表面性质的技术，能够在蛋白质表面形成功能化壳层，显著增强蛋白质稳定性和细胞穿透能力。本项目基于纳米胶囊技术，深入开展Cas9/sgRNA复合物的高效递送与调控研究，旨在进一步提升CRISPR的技术潜力及安全性。.通过制备荧光素酶生物发光纳米探针，分析Cas9/sgRNA复合物与递送载体自组装特性，建立基因编辑可视化细胞评价模型，我们基于血清白蛋白分子骨架设计合成出具有特定形貌、尺寸、界面等微观特性的纳米胶囊载体，在细胞水平实现了针对Cas9/sgRNA复合物的高效递送和精准调控。本项目研究表明，表面电位和可降解性是影响纳米胶囊细胞递送效率的关键参数。以质粒DNA为模式生物大分子，系统研究纳米胶囊载体介导的基因转染效率，我们发现含叔胺基聚合物的阳离子可降解纳米胶囊载体具有最高的转染效率(80%)，可使基因稳定表达4天以上。在此基础上通过荧光共振能量转移检测分子间相互作用，我们发现理性设计出的特定纳米胶囊载体能够与Cas9/sgRNA复合物形成非共价的自组装结构，并且能够在胞内生理环境下缓慢解离。亚细胞定位实验证实，经纳米胶囊载体递送的Cas9/sgRNA复合物能够逃逸内吞体/溶酶体，进入细胞内部发挥生物学功能，基因编辑效率分别在293T和A549细胞系中达到28%和40%左右。对于人原代T细胞我们同样实现了有活性的基因编辑，纳米胶囊载体递送Cas9/sgRNA复合物靶向CD7基因，流式细胞术和深度测序检测达到了13.3%的基因编辑效率。.我们开发了一种用于递送Cas9/sgRNA复合物的纳米胶囊递送载体，具有良好的生物相容性，为难以转染的原代T细胞提供了一种替代的基因编辑方法，有望用于CAR-T细胞治疗。