广西巴马小型猪内源性反转录病毒在人类基因组的整合机制及其影响的研究

Porcine endogenous retrovirus (PERV) is a virus that is closely related to xenograft Biosafety.There have been no conclusions so far as to whether it will cause diseases after it has been translated into the human body with a pig organ. That is why PERV has become a major internationally recognized obstacle that hinders the clinical application of xenotransplantation. As an excellent type, Guangxi Bama miniature pig (BM) is the most widely used pig in the present medical world in China, making it the best donor for xenograft. Studying the integration mechanism of PERV-BM in human cells as well as its resulting influence will be of great significance not only in further establishing virus security check system in human cells, but also in speeding up the development of Bama miniature pigs so as to achieve the industrialization of this type of pigs. Revolving around the molecular mechanism of PERV with the host cell, this project starts from the porcine endogenous retrovirus in Bama miniature pigs and researches into the long-term integration situations of the PERV of China's suburban successfully cultivated miniature pigs in the human genome as well as the impact of the PERV integration on the host cells. After identifying the distribution, the hot spots and the modes of the integration of PERV-BM in human genome, the research focuses on the impact of the integration on the proliferation and transformation of the host cells. Results of this research provide theoretical and experimental basis for further evaluation of the security of xenograft with PERV.

猪内源性反转录病毒（PERV）是与异种移植生物安全密切相关的病毒。到目前为止，它是否会随猪器官移植到人体后引起发病仍未有定论。PERV已经成为国际上公认的阻碍异种移植临床应用的一大障碍。广西巴马小型猪（BM）是目前医学上应用最广的优秀小型猪，也是异种移植的最佳供体。研究PERV-BM在人源细胞中的整合机制及其可能造成的影响，对进一步系统地建立病毒安全检查体系，加快开发巴马小型猪，实现小型猪的产业化发展具有重要的意义。项目以PERV-BM为研究切入点，围绕PERV与宿主细胞作用的分子机制，研究我国长期近郊培育成功的小型猪PERV在人类基因组的整合情况及PERV的整合对宿主细胞的影响。在明确PERV-BM在人类基因组中的整合分布情况、整合热点区域、整合方式之后，着重分析其对宿主细胞增殖、转化的影响情况，研究结果为进一步评价PERV与异种移植安全问题提供理论基础和试验依据。

猪内源性反转录病毒（PERV）是与异种移植生物安全密切相关的病毒。到目前为止，它是否会随猪器官移植到人体后引起发病仍未有定论，严重阻碍异种移植的发展。广西巴马小型猪（BM）是目前医学上应用最广的优秀小型猪，也是异种移植的最佳供体。项目以PERV-BM为研究对象，开展以下三个方面的研究：构建PERV-BM HEK293 细胞感染模型；研究PERV-BM 在人类基因组的整合机制；检测PERV-BM-HEK293细胞感染模型中原癌基因、抑癌基因及与细胞周期调控密切相关因子表达情况。项目以共培养方式构建了PERV-BM-HEK293细胞感染模型，在模型细胞传代中发现随着传代次数的增加，病毒基因组整合到细胞的拷贝数由开始时最高，然后慢慢减少，最后达到一种平衡与稳定；模型细胞与母本细胞HEK293相比，虽在细胞形态上无显著差异，但生长速度稍缓。以PERV-BM稳定整合HEK293细胞基因组为基础，通过检测确定了PERV-BM在人类基因组中104个整合位点并绘制整合分布图，分析发现大多数整合位点中PERV以较完整3’LTR整合且倾向于整合在基因转录起始位点、CpG岛等调控区域附近，因此PERV的整合存在潜在的危险性。项目建立了鉴定CyclinD1、CDK1、CDK4、c-myc、ras、P53、P16等表达情况的荧光定量PCR和Western Blot检测方法，通过检测上述因子表达情况时发现，细胞感染模型中抑癌基因与细胞周期调控相关因子的mRNA表达与对照细胞比较差异不显著，然而原癌基因c-myc在PERV-BM-HEK293细胞感染模型中表达成下调趋势，达两倍以上。上述研究结果初步表明PERV-BM在长期的进化过程中与猪体本身达成了一种平衡，病毒的整合对各种抑癌基因与细胞周期调控相关因子表达的影响并不大，初步表明以广西巴马小型猪做为异种移植供体安全性较好，但仍存在一定的潜在风险，需要进一步研究。