柳枝稷发酵产甲烷过程中纤维素降解机制及微生物多样性研究

Switchgrass (Panicum virgatum L.) is an important energy plant. However, because of its cell wall complex structure and recalcitrance, conversion rate of biomass is very low restricting the development of industrialization, of which high effective degradation and conversion are urgent. In the study, switchgrass of mature and elongation stage is going to feed experiment, respectively, and then collected rumen fluid to develop anaerobic digestion, which compared to co-fermentation production performance of biogas fluid with rumen fluid at different ratio. Analysis difference of lignocellulose hydrolysis and methane production by determination of conventional index and gas composition and identification of cell wall structure and components among for rumen fluid domesticated by low lignocelluloses+biogas fluid, rumen fluid domesticated by high lignocelluloses+biogas fluid; further analysis microbial diversity and dominance population of different fermentation fluids by High Throughput Sequencing Technology and PCR-DGGE. Clarify the relationships of different structure and components of cell wall and microbial diversity and dominance population, which have an effect on cellulose hydrolysis and methane production. Thus, the objectives of this study were to disclose mechanism of effective lignocelluloses hydrolysis and improve methane production. Those will lay the theoretical basis for industrial development of switchgrass.

柳枝稷是重要的能源植物，但其细胞壁结构复杂难于降解，生物质能转化效率低，制约产业化发展，其高效降解与转化亟待深入研究。本项目以结实期和拔节期的柳枝稷为粗饲料分别开展饲喂试验驯化瘤胃微生物，收集驯化后的瘤胃液与传统沼液以不同比例混合开展体外厌氧发酵试验。通过对低木质纤维素驯化瘤胃液+沼液，高木质纤维素驯化瘤胃液+沼液发酵体系的常规指标、气体成分的测定以及底物组成和细胞壁超微结构的鉴定，明确不同比例发酵液在木质纤维素降解率及甲烷生产性能方面的差别；进一步通过Illumina Miseq高通量测序技术和PCR-DGGE技术分析不同发酵液和底物柳枝稷附着微生物种群多样性和优势种群的差别。阐明柳枝稷木质纤维素组分和细胞壁超微结构的差异与微生物多样性和优势种群的关系，及其对纤维素降解率和甲烷产量的影响。揭示木质纤维素高效降解机制，提高甲烷产量，为柳枝稷大规模开发利用奠定理论基础。

柳枝稷是重要的生物质能源植物，但其细胞壁结构复杂，能源转化效率低。因此，阐明纤维素高效降解和甲烷高效生成的机制是解决木质纤维素利用率低和产气量低的关键问题。.试验一、柳枝稷厌氧发酵效果的研究。分别开展饲喂与体外厌氧发酵试验，共10组。柳枝稷为底物，37 °C发酵72 h。结果表明:10组发酵液在0-72h发酵过程中随时间的延长累积产气量、甲烷含量、固体分解量、纤维素和半纤维素的降解率以及氨态氮、总酸和酶活性呈增大趋势；二氧化碳含量、可溶性碳水化合物及pH 值呈下降趋势。瘤胃液单发酵木质纤维素的降解能力显著高于沼液，沼液单发酵的甲烷生产能力强于瘤胃液。瘤胃液与沼液以一定比例混合发酵的结果表明：二者混合发酵显著提高了木质纤维素的降解率，增大甲烷含量，提高发酵体系稳定性，低木质纤维素驯化瘤胃液与沼液混合比例为1：1的效果最好。瘤胃液添加提高了木质纤维素降解能力，沼液添加提高甲烷含量和发酵体系的稳定性，二者存在协同促进作用。.试验二、发酵过程微生物多样性的研究。分别收集10种发酵液样品，利用高通量技术探讨10种发酵液中细菌、真菌和古菌的多样性。结果表明，随着沼液添加量的增加，细菌群落丰富度降低、真菌和古菌物种多样性增加。当瘤胃液与沼液比例为1：1时，瘤胃液球菌科、理研菌科、普雷沃氏菌科和毛螺旋菌科占比显著提高（P＜0.05），新美鞭菌科数量显著增加，古菌中Miscellaneous_Crenarchaeotic_Group和甲烷粒菌科增加，其他菌群占比下降。L1:1混合的优势种群占比高于其他各组，细菌、真菌和古菌优势种群比例分别为66.83%、87.44%和97.72%。.试验三、柳枝稷细胞壁组成和超微结构鉴定。通过柳枝稷细胞壁组成和超微结构鉴定，发现纤维丝较原样变得疏松。随着沼液的增加，柳枝稷纹路下降，低木质纤维素的处理组软化程度高于高木质纤维素驯化瘤胃液。当瘤胃液和沼液比例为1：1时，纤维素分子的氢键分裂会松动，削弱衍射强度，结晶度降低，吸收峰最强。因此，低木质纤维素驯化瘤胃液与沼液1：1时更能有效低降解木质纤维素。...