转录因子AP-2B突变及多态性在维持动脉导管开放中的作用研究

Patent ductus arteriosus (PDA) is a common congenital heart disease(CHD) and it is essential for survival in some patients of complicated CHD. The previous study indicats that TFAP2B（transcription factor AP-2 beta ）plays a crucial role in the patency and closure of ductus arteriosus.However, the detailed mechanism is yet to be elucidated.In our previous work, we identified two types of mutations in TFAP2B: c.601+5G>A and c.435_438delCCGG from two PDA pedigrees. Furthermore,one novel single-nucleotide polymorphisms (SNP),c.1-34G>A,was detected with significant difference in PDA and control group . We assume that TFAP2B mutations/SNP will affect its transcription and translation and may involved in the pathlogical process of PDA.We will anlysis the function of TFAP2B in both in intro and in vivo through cell line transfection, mouse transgenic model. The aim of our study is to elucidate the mechanisms of TFAP2B in maintaining patency of ductus arteriosus.

动脉导管未闭（PDA）是常见的先天性心脏病，而部分复杂先天性心脏病患儿需依赖PDA存活，因此研究动脉导管闭合与开放机制有重要临床意义。研究发现转录因子AP-2B（TFAP2B）是调控动脉导管关闭的功能基因之一，但具体机制尚未明确。我们在前期PDA 家系、散发病例筛查中新发现2 种TFAP2B 突变c.601+5G>A、c.435_438delCCGG和1个有统计学差异的单核苷酸多态(SNP)c.1-34G>A。根据分子生物学理论分析推测这些新发现的TFAP2B 突变/SNP可影响蛋白质结构功能，可能为致病性突变或致病因素之一。为明确上述突变/SNP在PDA 发生中的作用，我们将通过构建突变基因/SNP体外表达载体研究其在细胞层面的影响，并建立携带突变基因的小鼠生物模型，观察其表型及对下游基因的影响，探索TFAP2B 突变/SNP在维持动脉导管开放中的作用。

动脉导管未闭（Patent ductus arteriosus, PDA）是常见的先天性心脏病，研究发现转录因子AP-2B (TFAP2B) 是调控动脉的导管关闭的功能基因之一，但具体机制尚未明确。我们在前期的PDA家系中新发现2种TFAP2B 突变c.601+5G>A、c.435_438delCCGG和1个有统计学差异的单核苷酸多态(SNP)c.1-34G>A.通过分析论证，其可能为致病性突变。首先通过构建真核细胞表达载体，我们发现c.435_438delCCGG突变使TFAP2B第二外显子丢失4个碱基，终止密码子提前出现，蛋白产物截短；c.601+5G>A突变则使得mRNA剪接错误，丢失第三外显子，并最终无蛋白产物表达，两种TFAP2B 突变都使得TFAP2B丧失转录激活活性。为进一步在模式生物水平明确这两种TFAP2B突变在维持动脉导管开放中的作用，我们利用CRISPR/Cas9的方法成功构建了Tfap2b c.435_438delCCGG和第3外显子条件性敲除小鼠（Tfap2b exon3 Flox小鼠模型）。我们发现Tfap2b c.435_438delCCGG突变小鼠产生一21KD左右的截短蛋白，出现动脉导管未闭和肾脏畸形，多数出生后3小时内即死亡，少数可活一天。突变小鼠动脉导管中平滑肌细胞分布稀疏、数量减少，收缩相关蛋白SM22α、MLCK表达下降，而细胞外基质Fibronectin升高，提示Tfap2b c.435_438delCCGG移码突变可能通过影响动脉导管收缩型平滑肌细胞发育导致动脉导管未闭畸形出现。此外，通过EIIα-CRE小鼠与与Tfap2b exon3 Flox小鼠交配获得的Tfap2b-KO小鼠进行表型观察发现，此基因突变小鼠出现早期死亡、发育异常，但并未发现存在明显的动脉导管未闭畸形。而通过对WNT1-CRE小鼠与Tfap2b exon3 Flox小鼠交配获得的WNT1-CRE/Tfap2bFlox/Flox小鼠表型观察发现，此基因突变小鼠存在明显发育迟缓、眼睛发育异常等畸形，突变鼠血清中IGF1下降，而GH代偿升高，经分析或与下丘脑调控异常有关。本研究首次发现Tfap2b c.435_438delCCGG移码突变是通过影响动脉导管收缩型平滑肌细胞发育，致使动脉导管平滑肌细胞数目减少，进而导致动脉导管未闭。